一种基于正相和反相高效液相色谱联用测定5-羟甲基糠醛及其衍生物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于正相和反相高效液相色谱联用测定5?羟甲基糠醛及其衍生物的方法。本发明是基于正相和反相高效液相色谱联用测定5?羟甲基糠醛、2，5?呋喃二甲醇、2，5?呋喃二甲醛、5?羟甲基?2?糠酸、5?甲酰基?2?糠酸和2，5?呋喃二甲酸的方法。采用Bio?Rad Aminex HPX?87H(300mm×7.8mm)正相色谱柱，通过硫酸等度洗脱，使用示差折光检测器，温度为35℃，定量测定2，5?呋喃二甲醇、2，5?呋喃二甲酸、5?羟甲基糠醛和2，5?呋喃二甲醛；采用Zorbax Eclipse XDS?C18(300mm×4.6mm)反相色谱柱，通过乙腈和醋酸二元梯度洗脱，使用可变波长检测器，紫外波长为275nm，定量测定5?甲酰基?2?糠酸和5?羟甲基?2?糠酸。通过正相和反相高效液相色谱联用，定量测定6种物质，显著提高了对上述呋喃类化合物的分离度及检测准确度。
【专利说明】
一种基于正相和反相高效液相色谱联用测定5-羟甲基糠醛及 其衍生物的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程、生物制药和化学工程领域，公开了一种基于正相和反相高 效液相色谱联用准确分离和定量测定多种呋喃化合物组分的方法，涉及到含有2,5-呋喃二 甲醇、5-羟甲基糠醛、2，5-呋喃二甲醛、5-羟甲基-2-糠酸、5-甲酰基-2-糠酸和2，5-呋喃二 甲酸的正相和反相高效液相色谱联用准确分离和精确定量测定。
【背景技术】
[0002] 5-羟甲基糠醛作为一种重要的生物基平台化合物，可经加氢、氧化脱氢、生物催化 甚至发酵转化生成2，5-呋喃二甲醇、5-羟甲基糠醛、2，5-呋喃二甲醛、5-羟甲基-2-糠酸、5-甲酰基-2-糠酸和2,5_呋喃二甲酸等一系列衍生物，他们作为重要的呋喃类原料再通过酯 化、卤化、聚合等反应可以生产出众多高附加值产品，广泛应用于燃料、医药、工程材料和精 细化工等众多领域，其合成与应用是生物质炼制产业发展的重要内容。
[0003] 目前上述呋喃类化合物的分离、分析和定量检测主要采用高效液相色谱法和气质 联用法。由于本发明所述的5-羟甲基糠醛及其五种衍生物的呋喃环碳骨架、支链的位置、官 能团分子大小、物性参数都非常相近，在单一的高效液相色谱检测时物质之间存在着互相 干扰导致难以有效分离鉴定或定量测定，一般仅能测定其中的3到4种物质，而采用气质联 用时通常需要对其中的2,5_呋喃二甲酸等高沸点物质进行衍生化处理，操作繁琐且容易引 起测量误差，结果重现性差且检测成本较高。
[0004] 基于以上所述，本发明采用正相和反相高效液相色谱联用，提供了一种快速、准确 同步分析和定量测定5-羟甲基糠醛及其衍生物的方法，尤其适用于生物质生物炼制合成上 述咲喃类平台化合物的分析和检测。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种基于正相和反相高 效液相色谱联用精确定量测定5-羟甲基糠醛及其衍生物的方法，以实现对以5-羟甲基糠醛 为底物进行的催化转化反应过程中各组分的精确定量检测。
[0006] 技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0007] 1、一种基于正相和反相高效液相色谱联用测定5-羟甲基糠醛及其衍生物的方法， 其特征在于，包括以下步骤：
[0008] (1)高效液相色谱系统与色谱条件：
[0009] 正相色谱：美国Agilentl260型高效液相色谱仪，采用Bio-Rad Aminex HPX-87H (300mmX 7.8mm)正相色谱柱带保护柱（30mmX4.6mm)，柱温55°C，自动上样，进样体积10 ·0μ L，以5mmol/L H2S04为流动相，流速为0.6mL/min;检测器为示差折光检测器，检测器温度为 35°C，采用色谱峰面积积分法测定各组分的含量。
[0010] 反相色谱：美国AgilentllOO型高效液相色谱仪，采用Zorbax Eclipse XDS-C18 (30〇111111\4.6111111)反相色谱柱带保护柱（3.〇111111\4.6111111)，柱温30<€，自动上样，进样体积10.0 yL;以100 %乙腈和1.5%醋酸为流动相，流速为Ο . 6mL/min，在Omin~20min内乙腈浓度从 5%升至50%，醋酸浓度从95%降至50%;检测器为可变波长检测器（VWD)，检测波长为 275nm，采用色谱峰面积积分法测定各组分的含量。
[0011] (2)色谱联用测定5-轻甲基糠醛及其衍生物：
[0012] 将2，5-呋喃二甲醇、5-羟甲基糠醛、2，5-呋喃二甲醛、5-羟甲基-2-糠酸、5-甲酰 基-2-糠酸、2，5-呋喃二甲酸标准品配制成0.4-1. Og/L的标准溶液。
[0013] 在正相色谱上，5-羟甲基-2-糠酸的出峰时间与5-甲酰基-2-糠酸的出峰时间重 叠，导致两种物质无法实现完全分离;在反相色谱上，2,5_呋喃二甲醇的出峰时间与5-羟甲 基糠醛的出峰时间重叠，导致两种物质无法实现完全分离。通过正相和反相高效液相色谱 的联合检测最终实现对5-羟甲基糠醛、2，5-呋喃二甲醇、2，5-呋喃二甲醛、5-羟甲基-2-糠 酸、5-甲酰基-2-糠酸和2,5_呋喃二甲酸的快速、精确的分离和定量测定。
[0014] 2、根据权利要求1所述的基于正相和反相高效液相色谱联用测定5-羟甲基糠醛及 其衍生物的方法，其特征在于，步骤(2)中，正相色谱上所分离物质的标准工作方程为：
[0015] 2，5-呋喃二甲醇 A = 806393 · 489 X cl-4722 · 254
[0016] 2，5-呋喃二甲酸 A= 186241 · 361 X c2-51 · 022341
[0017] 5-轻甲基糠醛 A= 187580 · 332 X c3-42 · 131853
[0018] 2，5-呋喃二甲醛 A= 199336 · 41 X c4-34 · 177678
[0019] 上述标准工作方程中，A表示色谱峰面积(nRIUXs)，c表示组分浓度(g/L)
[0020] 反相色谱上所分离物质的标准工作方程为：
[0021 ] 5-甲酰基-2-糠酸A = 53901 · 787 X C5-1228 · 0761
[0022] 5-轻甲基-2-糠酸 A= 18727 · 7606 X c6-376 · 46279
[0023] 上述标准工作方程中，A表示色谱峰面积(mAuXs)，c表示组分浓度(g/L)。
[0024] 高效液相色谱法是色谱法的一个重要分支，分离原理是根据被分离的组分在流动 相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。高效液相色谱具有分析 速度快、分辨率高、灵敏度高、柱子可反复使用和样品量少，容易回收的优点。而根据固定相 和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法常用于分离 中等极性和极性较强的化合物;反相色谱法适用于分离非极性和极性较弱的化合物。5-羟 甲基糠醛及其五种衍生物的呋喃环碳骨架、支链的位置、官能团分子大小、物质参数都非常 相近，在单一的高效液相色谱检测时物质之间存在着相互间干扰导致难以有效分离鉴定或 定量测定。
[0025]本发明的基于正相和反相高效液相色谱联用测定5-羟甲基糠醛及其衍生物的方 法，正是根据上述的正相和反相高效液相色谱特点和6种物质本身的性质有效结合，将2,5_ 呋喃二甲醇、5-羟甲基糠醛、2,5_呋喃二甲醛、5-羟甲基-2-糠酸、5-甲酰基-2-糠酸和2,5_ 呋喃二甲酸的标准品配制成标准溶液后，在给定的正相和反相高效液相色谱系统与色谱条 件下测出6种物质的标准工作方程。然后将以5-羟甲基糠醛为底物进行催化转化得到的待 测样品在同样的正相和反相高效液相色谱系统与色谱条件下进行测定，并根据标准工作方 程换算获得待测样品的定量测定值。
[0026]有益效果:本发明的基于正相和反相高效液相色谱联用测定5-羟甲基糠醛及其衍 生物的方法，与现有的测定方法相比，具有的优点包括:基于正相和反相高效液相色谱联用 精确定量测定5-羟甲基糠醛及其衍生物的方法，采用Bio-Rad Aminex HPX-87H(300mmX 7.8mm)正相色谱柱，通过硫酸等度洗脱，使用示差折光检测器，温度为35°C的条件下测定吸 光值，定量测定2，5-呋喃二甲醇、2，5-呋喃二甲酸、5-羟甲基糠醛和2，5-呋喃二甲醛;采用 Zorbax Eclipse 乂05-〇18(30〇111111\4.61]1111)反相色谱柱，通过乙腈和醋酸二元梯度洗脱，使 用可变波长检测器，在紫外波长275nm处测定吸光值，定量测定5-羟甲基-2-糠酸和5-甲酰 基-2-糠酸。提供了一种快速、准确同步分析和定量检测5-羟甲基糠醛及其衍生物的方法， 尤其适用于生物质生物炼制合成上述呋喃类平台化合物的分析和检测。
【附图说明】
[0027] 图1为2，5-咲喃二甲醇、2，5-咲喃二甲酸、5-轻甲基糠醛和2，5-咲喃二甲醛标准样 品的正相高效液相色谱测定的图谱。图中横坐标表示组分的保留时间RT(min)，纵坐标表示 示差检测器所得到的信号(nRIU)。
[0028] 图2为5-甲酰基-2-糠酸和5-羟甲基-2-糠酸标准样品的反相高效液相色谱测定的 图谱。图中横坐标表示各种组分的保留时间RT(min)，纵坐标表示可变波长检测器所得到的 信号(mAu)。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。
[0030] 实施例1正相高效液相色谱系统与色谱条件
[0031] 正相高效液相色谱系统:德国Agilent 1260液相色谱系统，配置真空脱气机、示差 折光检测器(RID)和系统自动进样器，色谱系统的运行软件采用安捷伦化学工作站B.01.01 版本，色谱条件：Bio-Rad Aminex HPX-87H(300mmX7.8mm)色谱柱带保护柱（30mmX 4 · 6mm)，柱温55 °C，进样体积 10 · OyL;
[0032] 流动相条件：以5mmol/L H2S04为流动相进行等梯度洗脱，流速为0.6ml/min;
[0033] 信号检测:检测器为示差折光检测器，检测器温度为35°C，采用色谱峰面积积分法 测定2，5-呋喃二甲醇、2，5-呋喃二甲酸、5-羟甲基糠醛和2，5-呋喃二甲醛的含量。
[0034] 实施例2反相高效液相色谱系统与色谱条件
[0035] 反相高效液相色谱系统:德国Agilent 1100液相色谱系统，配置真空脱气机、可变 波长检测器(VWD)和系统自动进样器，色谱系统的运行软件采用安捷伦化学工作站A. 10.XX 版本，色谱条件:Zorbax Eel ipse XDS_C18( 300mm X 4.6mm)反相色谱柱带保护柱(3.0mm X 4 · 6mm)，柱温30 °C，进样体积 10 · OyL;
[0036] 洗脱条件：以1.5%醋酸和100%乙腈为流动相进行变浓度梯度洗脱，流速为 0.61111^/111；[11。在0111；[11~20111；[11内乙臆浓度从5%升至50%，醋酸浓度从95%降至50%;20111；[11~ 20.1111；[11内乙腈浓度从50%迅速降至5%，醋酸浓度从50%迅速升至95%;20.1111；[11~25111；[11 内以5 %浓度的乙腈和95 %浓度的醋酸对柱子进行再生和平衡。
[0037]信号检测:可变波长检测器(VWD)，检测波长为275nm，采用色谱峰面积积分法测定 5-甲酰基-2-糠酸、5-羟甲基-2-糠酸的含量。
[0038]实施例36种物质标准工作方程的测定
[0039] 测定6种物质的标准工作方程:2,5-呋喃二甲醇购自上海麦克林公司；5-羟甲基糠 醛、2，5-呋喃二甲酸购自上海阿拉丁公司；5-羟甲基-2-糠酸、2，5-呋喃二甲醛、5-甲酰基-2_糠酸购自日本TCI公司，将其配制成0.4~1.0g/L的标准溶液，采用上述正相和反相高效 液相色谱系统和色谱条件测定6种物质的标准工作方程，测定结果如图1、图2和表1、表2所 示。图中各色谱峰分别为：1.2,5_呋喃二甲醇;2.2,5_呋喃二甲酸;3.5-羟甲基糠醛;4.2,5_ 呋喃二甲醛;5.5-甲酰基-2-糠酸;6.5-羟甲基-2-糠酸。
[0040] 表1 5-轻甲基糠醛及其衍生物正相高效液相色谱标准工作方程测定
[0041]
[0043] 正相高效液相色谱上色谱峰保留时间RT(min):2,5-呋喃二甲醇13.703;2,5_呋喃 二甲酸16.151; 5-羟甲基糠醛31.995; 2，5_呋喃二甲醛39.114。
[0044] 正相色谱上所分离物质的标准工作方程为：
[0045] 2，5-呋喃二甲醇 A = 806393 · 489 X cl-4722 · 254，相关系数 R2 = 0 · 99807
[0046] 2，5-呋喃二甲酸 A= 186241 · 361 X c2-51 · 022341，相关系数 R2 = 1 · 00000
[0047] 5-轻甲基糠醛 A= 187580 · 332 X c3-42 · 131853，相关系数 R2 = 0 · 99999
[0048] 2，5-呋喃二甲醛 A= 199336 · 41 X c4-34 · 177678，相关系数 R2 = 1 · 00000
[0049] 上述标准工作方程中，A表示色谱峰面积(nRIUXs)，c表示组分浓度(g/L)
[0050] 表2 5-轻甲基糠醛及其衍生物反相高效液相色谱标准工作方程测定
[0051]
[0052] 反相高效液相色谱上色谱峰保留时间RT(min): 5-甲酰基-2-糠酸6.505 ; 5-羟甲 基-2-糠酸6.837;
[0053] 标准工作方程：
[0054] 5-甲酰基-2-糠酸A = 53901 · 787 X C2-1228 · 0761，相关系数R2 = 0 · 99644
[0055] 5-轻甲基-2-糠酸 A= 18727 · 7606 X c3-376 · 46279，相关系数 R2 = 0 · 99782
[0056] 标准工作方程中，A表示色谱峰面积(mAuXs)，c表示组分浓度(g/L)
[0057] 实施例4实际样品的成分分析与测定
[0058]以5-羟甲基糠醛作为底物经过微生物催化反应后得到实际转化产物，将发酵液在 lOOOOrpm条件下离心5min后以0.2μπι微滤膜过滤上清液得到样品液，再转入色谱仪自动上 样瓶进行色谱测定。
[0059] 分析和定量测定5-羟甲基糠醛及其衍生物样品：采用外标法以上述6种组分的标 准工作方程精确定量测定以5_羟甲基糠醛为底物得到的转化产物中各组分的含量。
[0060] 采用实施例1，实施例2和实施例3的方法可实现样品中的6种组分高效快速分离和 准确定量检测，以5-羟甲基糠醛为底物进行微生物催化转化，12h后，底物5-羟甲基糠醛转 化率为80%，各转化产物得率分别为:2，5-呋喃二甲酸10%，5-甲酰基-2-糠酸5%，5-羟甲 基-2-糠酸60%，2,5_呋喃二甲醛3%，2,5_呋喃二甲醇22%。
【主权项】
1. 一种基于正相和反相高效液相色谱联用测定5-羟甲基糠醛及其衍生物的方法，其特 征在于，包括以下步骤： (1) 高效液相色谱系统与色谱条件： 正相色谱：美国Agilentl260型高效液相色谱仪，采用Bio-Rad Aminex HPX-87H(300_ X 7 · 8mm)正相色谱柱带保护柱（30mmX4 · 6mm)，柱温55°C，自动上样，进样体积10 · OyL，以 5mmol/L H2S04为流动相，流速为0.6mL/min;检测器为示差折光检测器，检测器温度为35 °C，采用色谱峰面积积分法测定各组分的含量； 反相色谱:美国AgilentllOO型高效液相色谱仪，采用Zorbax Eclipse XDS_C18(300mm X4.6mm)反相色谱柱带保护柱（3.0mmX4.6mm)，柱温30°C，自动上样，进样体积lO.OyL;以 100 %乙腈和1.5 %醋酸为流动相，流速为0.6mL/min，在Omin~20min内乙腈浓度从5 %升至 50%，醋酸浓度从95%降至50% ;检测器为可变波长检测器(VWD)，检测波长为275nm，采用 色谱峰面积积分法测定各组分的含量； (2) 色谱联用测定5-羟甲基糠醛及其衍生物： 将2，5-呋喃二甲醇、5-羟甲基糠醛、2，5-呋喃二甲醛、5-羟甲基-2-糠酸、5-甲酰基-2-糠酸和2，5-呋喃二甲酸标准品配制成0.4-1.0g/L的标准溶液； 在正相色谱上，5-羟甲基-2-糠酸的出峰时间与5-甲酰基-2-糠酸的出峰时间重叠，导 致两种物质无法实现完全分离;在反相色谱上，2,5_呋喃二甲醇的出峰时间与5-羟甲基糠 醛的出峰时间重叠，导致两种物质无法实现完全分离。通过正相和反相高效液相色谱的联 用，最终实现对5-羟甲基糠醛、2,5_呋喃二甲醇、2,5_呋喃二甲醛、5-羟甲基-2-糠酸、5-甲 酰基-2-糠酸和2,5_呋喃二甲酸的快速、精确的分离和定量测定。2. 根据权利要求1所述的基于正相和反相高效液相色谱联用测定5-羟甲基糠醛及其衍 生物的方法，其特征在于，步骤(2)中，正相色谱上所分离物质的标准工作方程为： 2，5-呋喃二甲醇A = 806393 · 489 X c 1-4722 · 254 2,5_ 呋喃二甲酸 A=186241.361 Xc2-51.022341 5-羟甲基糠醛A= 187580 · 332 X c3-42 · 131853 2，5-呋喃二甲醛 A= 199336 · 41 X c4-34 · 177678 上述标准工作方程中，A表示色谱峰面积(nRIUXs)，c表示组分浓度(g/L) 反相色谱上所分离物质的标准工作方程为： 5-甲酰基-2-糠酸A = 53901 · 787 X C5-1228 · 0761 5-羟甲基-2-糠酸A= 18727 · 7606 X c6-376 · 46279 上述标准工作方程中，A表示色谱峰面积(mAu X s)，c表示组分浓度(g/L)。
【文档编号】G01N30/02GK105974022SQ201610347503
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】徐勇, 盛烨泉, 朱均均, 连之娜, 余世袁, 勇强, 欧阳嘉
【申请人】南京林业大学