利用超高效液相色谱串联质谱快速定量测定婴幼儿配方奶粉中L‑肉碱的方法与流程

本发明涉及食品检验技术领域，尤其是一种婴幼儿配方奶粉中L-肉碱的快速定量检验方法。

背景技术：

L-肉碱（L-Carnitine），化学名为3-羧基-4-N-三甲基-氨基丁酸（3-Hydroxy-4-N-trimethyla minobutyrate）,是一种在人体中广泛存在的类氨基酸，主要分布在肌肉、心脏中，其主要功能是转运脂肪进入线粒体，促进脂肪酸燃烧，为机体提供能量^[1-3]，人不仅可通过食物获取L-肉碱，且在体内可自行合成^[4]，但婴幼儿自身合成能力较低，因此必须在婴幼儿食品中补充。

国标GB10765-2010《食品安全国家标准婴儿配方食品》规定：L-肉碱为可选择性加入成分，规定最小添加量为0.3mg/100KJ^[5]。目前关于婴幼儿配方奶粉中L-肉碱的检测，国标为GB29989-2013^[6]，分光光度计法，但由于显色液配置复杂；乙酰辅酶A和乙酰肉碱转移酶不稳定，往往使检测结果重复性差，且检出限较高（0.6mg/100g）。文献报道的L-肉碱检测方法主要有酶显色法^[7-9]、离子色谱法^[10-11]、高效液相色谱法^[12-14]等。相关参考文献信息如下：

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技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种利用超高效液相色谱串联质谱快速定量测定婴幼儿配方奶粉中L-肉碱的方法，不仅操作步骤简单，避免了复杂步骤造成的目标物的损失，同时具有分析速度快，灵敏度高，重复性好的突出特点。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

利用超高效液相色谱串联质谱快速定量测定婴幼儿配方奶粉中L-肉碱的方法，包含如下主要步骤：

A、液相色谱-质谱分析前处理操作：取待测样品首先溶解在浓盐酸中，然后进行超声提取，碱中和后过滤取滤液备用，与此同时利用L-肉碱标准品配制标准液；

B、液相色谱-质谱分析上机测定：步骤A所得的样品溶液及标准液分别上机进行液相色谱-质谱分析测定，分析比对得出婴幼儿配方奶粉中L-肉碱的定量含量。

作为本发明的一种优选技术方案，该方法包含如下主要步骤：

A、液相色谱-质谱分析前处理操作：对待测样品进行系列处理制备待测溶液，同时利用标准品配制标准液：

A-1、样品前处理：准确称取1.00g混合均匀的待测婴幼儿配方奶粉样品置入三角瓶中，加入含有0.5-2mmol盐酸的溶液，超声提取10-30min，然后用氢氧化钠调节pH至4-5，定容后过滤，滤液备用；

A-2、标准液的配制：称取L-肉碱纯品逐级稀释得到浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL 的标准工作液；

B、液相色谱-质谱分析上机测定：将步骤A所得的样品溶液及标准工作液分别上机进行液相色谱-质谱分析测定，制作标准曲线并对样品溶液的测定数据进行比对，得出婴幼儿配方奶粉中L-肉碱的定量含量；其中：

B-1、色谱条件设定为：色谱柱为CORTECS HILIC，规格3.0mm×100mm，2.7μm，柱温20-30℃，进样量1.5-2.5μL，流速0.2-0.4ml/min，采用甲醇-0.1%（v/v）甲酸为流动相；

B-2、质谱条件设定为：离子源为电喷雾ESI离子源，正离子扫描模式，扫描方式为多反应监测MRM，毛细管电压为3-5KV，雾化气和碰撞气为高纯氮，干燥气流速为5-20L/min，干燥气温度为200℃以上。

作为本发明的一种优选技术方案，该方法包含如下主要步骤：

A、液相色谱-质谱分析前处理操作：对待测样品进行系列处理制备待测溶液，同时利用标准品配制标准液：

A-1、样品前处理：准确称取1.00g（精确到0.1mg）混合均匀的待测婴幼儿配方奶粉样品于100mL三角瓶中，加入10mL 0.1mol/L盐酸和30mL水，超声提取15min，然后用4%氢氧化钠调节pH至4.5，定容至100mL，过滤，滤液过0.22μm滤膜，备用；

A-2、标准储备液的配制：称取L-肉碱1.00000g于100mL容量瓶中，超纯水溶解定容、混匀，得到浓度为10mg/mL的标准储备液；

A-3、标准工作液的配制：取奶粉空白试样，按照步骤A-1的方法进行前处理，以得到的滤液作为溶剂配置系列标准工作液，将L-肉碱标准储备液逐级稀释得到浓度为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL 的标准工作液，现用现配；

B、液相色谱-质谱分析上机测定：将步骤A所得的样品溶液及标准工作液分别上机进行液相色谱-质谱分析测定，制作标准曲线并对样品溶液的测定数据进行比对，得出婴幼儿配方奶粉中L-肉碱的定量含量；其中：

B-1、色谱条件设定为：色谱柱为CORTECS HILIC，规格3.0mm×100mm，2.7μm，柱温25℃，进样量2μL，流速0.3ml/min，以甲醇-0.1%（v/v）甲酸、体积比20:80为流动相；

B-2、质谱条件设定为：离子源为电喷雾ESI离子源，正离子扫描模式，扫描方式为多反应监测MRM，毛细管电压为4KV，雾化气和碰撞气为高纯氮，干燥气流速为10L/min，干燥气温度为350℃。

作为本发明的一种优选技术方案，步A-1中超声提取作业的具体参数为：工作频率40KHz，功率250W。

作为本发明的一种优选技术方案，步骤B-2中，质谱分析的参数如下表所示：

*为定量离子。

作为本发明的一种优选技术方案，待测样品采用婴幼儿配方奶粉质控样品，左旋肉碱标准品采用纯度>98%的产品，浓盐酸为分析纯，氢氧化钠为分析纯，冰乙酸为优级纯，甲酸为色谱纯，乙腈和甲醇均为色谱纯，超纯水为实验用超纯水。

作为本发明的一种优选技术方案，测定设备采用配有电喷雾离子源的Agilent 1290 LC/6420 MS 液相色谱-质谱联用仪，采用KQ3200 DB型数控超声波清洗器，酸碱测定采用PB-10 pH计，称量操作采用AL 204-IC电子天平和XS 2050U电子分析天平。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明的检验方法不仅操作步骤简单，避免了复杂步骤造成的目标物的损失，同时具有分析速度快，灵敏度高，重复性好的突出特点。本发明中待测样品在5min内完成分析，L-肉碱在10～1000.0ng/mL范围内线性关系良好（r=0.9993），方法的低、中、高三个水平的加标回收率为82.43%～96.91%，相对标准偏差在1.46%～5.65%，检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为0.1μg/kg，1.0μg/kg。本发明的技术方案不仅适用于实验室检测、企业大批量质控检测，由于其快速准确的特点，极有可能发展为婴配奶粉相关检测的行业标准乃至国家标准，具有重要的意义和价值。本发明有益效果的具体试验数据参见下文的实施例。

附图说明

图1显示实施例1中不同超声提取时间所得到L-肉碱含量。

图2是实施例4中HILIC柱对L-肉碱的多反应检测色谱图。

图3是实施例5中L-肉碱的ESI/MS/MS质谱图。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。

本发明采用的材料、试剂及仪器设备介绍如下。材料：婴配奶粉，质控样品。试剂：左旋肉碱标准品：CAS 541-15-1，纯度>98%（sigma公司）；浓盐酸为分析纯（利安隆博华天津医药化学有限公司）；氢氧化钠为分析纯（天津市德恩化学试剂有限公司）；冰乙酸为优级纯（天津市光复科技发展有限公司）；甲酸为色谱纯（Dikma公司）；乙腈和甲醇均为色谱纯（Fisher chemical公司）；实验用超纯水（由Millipore Milli-Q系统净化蒸馏水获得）。仪器设备：Agilent 1290 LC/6420 MS 液相色谱-质谱联用仪（配有电喷雾离子源，美国安捷伦公司）；KQ3200 DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；PB-10 pH计（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；AL 204-IC电子天平、XS 2050U电子分析天平（特勒-托利多仪器上海有限公司）。

实施例1、样品前处理操作中对超声时间的优化探究

对于奶粉中L-肉碱的检测，既要保证样品的均一性，又要减少样品基质中常量目标化合物对仪器的污染。本发明的研究从原始固体样品中取出部分代表性样品，充分混合，用四分法缩分，再准确称取样品，加入盐酸溶液进行超声提取。其中对超声时间的优化探究如下。

分别称取同一份样品五份，加入盐酸溶液后，分别超声5min、10min、15min、20min、25min，然后检测，最终提取结果参见附图1，可见超声提取时间不同提取效果不同，但15min左右达到综合最优化，因此本发明组最终选择超声提取15min。

实施例2、样品前处理操作中对最终pH优化探究

用氢氧化钠溶液调节pH梯度，3.5，3.8，4.0，4.5，5.0，7.0，并分别上机检测L-肉碱含量，只有在pH为4.5时，蛋白沉淀完全，滤液澄清，且在LC/MS/MS中色谱峰形最佳，因此样品前处理操作中对将最终pH确定为4.5。

实施例3、样品前处理操作中对样品稀释倍数的优化探究

由于LC/MS/MS仪器灵敏度高，必须使样品进行一定倍数的稀释才能使处理液中L-肉碱含量在仪器的最佳线性范围内。且稀释还可以使样品基质的抑制减小，使仪器的信噪比降低，提高灵敏度。经过试验最终选择在处理液定容100ml之后，此时还必须过0.22μm滤膜才能达到较好的测定效果；所得滤液再用超纯水稀释5倍为最优。

实施例4、色谱条件的优化探究

L-肉碱是一种小分子强极性化合物，没有特殊的紫外吸收，先前的研究都是通过衍生化反正来减少L-肉碱的极性，使其带有生色团的同时更适合于在反相条件的保留，本实验不需衍生，分别对比了C18柱、C4柱和HILIC柱的分离效果，发现C18柱、C4柱基本在死时间出峰，且拖尾现象严重，而HILIC柱保留时间适中，峰形很好，见附图2，适合定量分析。

实施例5、质谱条件的优化探究

L-肉碱分子结构中含有季铵碱性集团，适合用电喷雾离子源，正离子检测方式，L-肉碱的准分子离子[M+H]⁺质核比m/z为162.2，选择其作为母离子并进行下一步碰撞诱导解离，对碰撞能量、碎裂电压、干燥气流速、温度进行优化。二级质谱显示信号最强烈的碎片离子质核比m/z为103.1,85.2和60.3。由附图3可知，信号最高为m/z103.1碎片离子可作为定量离子，其次是m/z60.3作为定性离子，最终质谱分析参数见表1。在检测过程中，采用切换法，将L-肉碱出峰前和出峰后的色谱柱流出液导入废液通道，避免因离子源污染而导致信号抑制，信噪比减小，提高了仪器的准确度和灵敏度。

实施例6、对本发明测定方法的方法学验证

1、线性范围和检出限

用超纯水配置L-肉碱浓度系列标准溶液进行LC/MS/MS测定，以各组分响应值（Y）和相对应的质量浓度（X）作标准曲线。实验表明，L-肉碱在10～1000ng/ml范围内线性关系良好，r=0.9993。可以满足定量分析的需要，结果计算采用外标法定量。

取储备液逐级稀释，进样量2μL。以信噪比S/N=3计算L-肉碱的检出限（LOD）和S/N=10计算定量限（LOQ）分别为0.1μg/kg，1μg/kg，能够满足实际样品分析对检测限的要求。

2、回收率和精密度

分别取婴配基质奶粉样品两个和购买的质控样品两个，按本方法测定其中的L-肉碱本底含量。另向奶粉样品中分别加入8.0、16.0、32.0mg/100g的标准品，质控样品中分别加入5.0、10.0、20.0mg/100g的标准品，每个样品平行测定5次，计算其加标回收率和相对标准偏差，结果见表2。由表2可知，质控样品检测结果，与真值9.9mg/100g满足误差范围。L-肉碱的加标回收率为82.43%～96.91%，相对标准偏差在1.46%～5.65%。方法显示了较好的回收率及重复性，能够满足实际样品的分析要求。

表2 L-肉碱的回收率和精密度（n=5）

Tab.2 Recovery and precision of L-carnitine（n=5）

3、方法重现性

通过同一仪器、同一实验员、同一天对同一质控样品按本方法进行连续检测3d，每天重复测定（n=5），考察方法的重现性，结果方法的日内精密度为2.6%，日间精密度为5.7%，表明方法重现性良好。

综上所述，本发明的方法基于酸水解超声提取的高效快速，高效液相色谱-质谱法的高分离能力和高灵敏度，通过对样品前处理和液相色谱-质谱条件的优化，建立了一种适用于婴幼儿奶粉复杂基质的L-肉碱的快速检测技术。本方法采用CORTECS HILIC色谱柱进行分离，以甲醇-0.1%甲酸为流动相，流速0.3ml/min，在优化条件下，样品在5min内完成分析，分析速度快，L-肉碱在10～1000.0ng/mL范围内线性关系良好，检出限低。该方法操作简便、灵敏度高、重复性好，可用于大量婴幼儿配方奶粉样品中的L-肉碱的快速测定。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。