用色谱法分析某种特定样品的方法

专利名称：用色谱法分析某种特定样品的方法
技术领域：
本发明涉及一种用高效液相色谱法分析特定样品的方法，具体地说是一种定量分析HMPAO非对映异构体和d，l-HMPAO冻干药盒的方法。
专利文献EP-0194843(1986年)和英国Amersham公司的工作报告(见J.Nucl.Med.，28，191，1987)公开了采用正相高效液相色谱法分析HMPAO非对映异构体(即meso-HMPAO内消旋-六甲基丙二胺肟和d，l-HMPAO外消旋-六甲基丙二胺肟)的方法，该法的不足之处是1，只能定性分析HMPAO非对映异构体;2，该法的流动相不理想，需要予柱。通常正相高效液相色谱法的色谱柱为硅胶柱，流动相为非极性试剂，而该法的流动相采用极性试剂为CH3OH∶0.4mol NH4OH(85∶15，V/V)。这样流动相中的水份不可避免地会使硅胶柱的性能退化，必须在色谱系统中增加予柱。而一根予柱的价格较高。3，该法不灵敏。其样品浓度为10mg/ml，进样体积为10μl，相当进样量为100μg，这样大的进样量表明该法不灵敏。4，该法的分离时间长且分离度不好。其meso-HMPAO和d，l-HMPAO的保留时间各为8.9min和9.87min，△tR＝1min，说明两色谱峰分离不好。5，该法的色谱系统中使用可调紫外检测器，其价格昂贵(8千美元)。贾少微等人(见北京医科大学学报增刊，21，11，1989)所报导的反相高效液相色谱法定性分析d，l-HMPAO药盒(Ceretec，Amersham International PIC，UK)，仅分析三次样品。此法的分离结果不能重复，更不能定量分析药盒。
本发明的目的在于提供一种应用反相高效液相色谱法定量分析HMPAO非对映异构体的方法，该方法能分析出HMPAO非对映异构体的纯度和d，l-HMPAO药盒中的杂质meso-HMPAO，确定d，l-HMPAO的含量，并具有灵敏度高、精密度好、快速、稳定和简便等优点。
近年来英国推出一种新的放射性药物-Tc-99m-d，l-HMPAO注射液，它能够通过完整无损的血脑屏障，并较长时间地滞留在脑内，是一种新的SPECT脑灌注显像剂，它是由d，l-HMPAO药盒和Mo-99-Tc-99m发生器的洗脱液配制成的。d，l-HMPAO药盒为外消旋-六甲基丙二胺肟、氯化亚锡和氯化钠经冷冻干燥的无菌无热原粉末。HMPAO可以d，l-HMPAO和meso-HMPAO非对映异构体存在，此两化合物分子中只有一个氢原子的位置不同(

图1)且d，l-HMPAO在一定条件下极易转变成为杂质meso-HMPAO，此杂质是影响该药盒质量的关键。
本发明应用反相高效液相色谱法定量分析一种新的放射性药物Tc-99m-d，l-HMPAO注射液的配体原料-HMPAO非对映异构体的纯度和放射性药物的配体-d，l-HMPAO冻干药盒中的d，l-HMPAO的含量，它们是该药物质量控制的关键指标。
我们给出一种最佳的流动相二氯甲烷∶甲醇∶乙醇(800-100∶1-25∶1-8，V/V)，使本工作能在普通的仪器条件下完成，并得到满意的结果，已成功地用于我院合成的HMPAO非对映异构体以及我院和英国Amersham公司的d，l-HMPAO冻干药盒的质量控制。
利用反相高效液相色谱法定量分析HMPAO非对映异构体的方法，其具体流程(见图2)是新鲜配制的流动相经抽气过滤、负压脱气后进入色谱系统。取新鲜配制的样品溶液3-10μl，由进样器注入。样品随着流动相经色谱柱被分离，再通过紫外检测器后收集。来自检测器的输出信号直接送予数据处理机，同时在该机上得到meso-HMPAO和d，l-HMPAO各组份的分离谱图、保留时间和色谱峰积分的结果等。d，l-HMPAO的含量可由数据处理机的外标准定量法或由meso-HMPAO标准曲线法而获得。
本发明有下列附图图1 HMPAO的非对映异构体 ＊-Me 表示-CH3图2主要流程示意3HMPAO和药盒的色谱图样品Ⅰ.d，L-HMPAO药盒溶液Ⅱ.d，l-HMPAO溶液Ⅲ.meso-HMPAO溶液组分1.meso-HMPAO2.d，l-HMPAO图4与已有技术的高效液相色谱图对比谱图A.英国分析的HMPAO非对映异构体
B.本法分析的d，l-HMAPO药盒C.本法分析的HMPAO非对映异构体组分1.meso-HMPAO2.d，l-HMPAO图5药盒样液的稳定性谱图贮存温度20℃，贮存时间(min)I.7，Ⅱ.37，Ⅲ.360组分1.meso-HMPAO2.d，l-HMPAO图6CeretecLotA163样液的稳定性谱图贮存温度-20℃，贮存时间(h)Ⅰ.0.1，Ⅱ.68;
组分1.meso-HMPAO，2.d，l-HMPAO本发明的定量方法外标准定量法，使用含meso-HMPAO和d，l-HMPAO的标准混和液，按数据处理机的外标准定量法程序操作，得到d，l-HMPAO的含量。标准曲线法，取适量的meso-HMPAO结晶体配成的标准液，其进样量由小至大依次注入色谱系统，进样两次，取色谱峰积分结果(或测峰高结果)的平均值与进样量制得标准曲线。在同样的色谱条件下，由待测样品溶液的meso-HMPAO色谱峰积分结果(或测峰高结果)，查标准曲线得到meso-HMPAO的含量，最后计算出该待测样品的d，l-HMPAO的含量。
色谱参数检测器的紫外波长254nm和灵敏度为0.1AUFS，数据处理机的纸速为1cm/min。色谱柱为μBondapak C18，10μm，φ3.9×300mm，流速为1ml/min，泵压为25Kgf/cm2。
在本法的工作条件下，测得meso-HMPAO的进样量在1×10-8g-1×10-7g范围内的标准曲线，其进样量和峰高成线性关系。
本法快速、准确，分离时间短，仅在5min内就能分离分析出HMPAO非对映异构体。meso-HMPAO和d，l-HMPAO的保留时间分别为2.9min和4.7min。分离度大于5，分析结果准确。
本法灵敏且精密度好。d，l-HMPAO和杂质meso-HMPAO的最小检出量分别为5×10-7g和1×10-8g。它们的测得值分别为2.6×10-6g和1×10-7g时，变异系数小于13%。
我院和Amersham公司的d，l-HMPAO冻干药盒溶液在本法的工作条件下，稳定性都很好。
实验中所用试剂、样品和仪器甲醇、乙醇和二氯甲烷等均为分析纯，所用水为二次蒸馏水。
HMPAO非对映异构体，由我院同位素所提供的meso-HMPAO和d，l-HMPAO。
d，l-HMPAO冻干药盒，分别由我院和英国Amersham公司提供的产品。
样品溶于流动相中，浓度为0.1-0.3mg/ml。
美国WatersALC/GPC-244型高效液相色谱仪，包括M6000A泵，U6K进样器，M440紫外检测器(254nm)和M730数据处理机。瑞士Mettle，AT250电子天平。冰箱。
本发明与已有技术相比所具有的优点1.本法能定量分析HMPAO非对映异构体的纯度和药盒中d，l-HMPAO含量(见图3)，如本院合成的meso-HMPAO和d，l-HMPAO异构体以及生产的d，l-HMPAO药盒;英国生产的Ceretec药盒。
2.我们采用反相高效液相色谱法，给出一种最佳的流动相，无需予柱。
3.本法灵敏且精密度好，样品的浓度为0.1～0.3mg/ml，进样体积为10μl，相当于进样量为0.1-3μg。
4.本法的分离时间短且高效液相色谱图(图4)好于英国Amersham公司发表的色谱图。在本工作条件下，分离时间仅5min。
5.本法使用普通紫外检测器(254nm)，比EP-0194843专利报导的可调紫外检测器的价格低，单此项费用就可节约外汇4仟美元。
6.在本工作条件下，d，l-HMPAO药盒的样液稳定性很好。图5和图6分别示出本院药盒样液在常温下和英国Ceretec样液在-20℃下，于6个小时和3天内不同时间所获得的高效液相色谱图。
7.高效液相色谱法定量分析样品必须使用标准品，本发明采用本院合成的纯mesO-HMPAO异构体取代了英国Amersham公司的试剂作为本工作的标准品，节省了外汇(每次分析需价值90英镑的标准品)。
本发明与已有技术相比，具有准确，快速，稳定和简便等优点，适于HMPAO非对映异构体的纯度和d，l-HMPAO药盒的质量测试工作，并已成功地用于该药盒的原料和产品的测试。
权利要求
1.用色谱法分析某种特定样品的方法，采用反相液相色谱法定量分析HMPAO非对映异构体和d，l-HMPAO冻干药盒，其特征在于1)配制流动相，由二氯甲烷、甲醇、乙醇组成，新鲜配制的流动相经抽气过滤、负压脱气后进入色谱系统；2)取新鲜配制的样品溶液，由进样器注入色谱柱，样品随着流动相经色谱柱被分离；3)通过一般的紫外检测器后收集；4)来自检测器的输出信号直接送予数据处理机，同时在该机上得到meso-HMPAO和d，l-HMPAO各组分的分离谱图、保留时间和色谱峰积分等的结果，d，l-HMPAO的含量可由数据处理机的外标准定量法或由meso-HMPAO标准曲线法而获得。
2.按照权利要求1所述的用色谱法分析某种特定样品的方法，其特征在于流动相二氯甲烷∶甲醇∶乙醇＝800-1000∶1-25∶1-8，V/V。
3.按照权利要求1或2所述的用色谱法分析某种特定样品的方法，其特征在于所说的外标准定量法为使用含meso-HMPAO和d，l-HMPAO的标准混合液，按数据处理机的外标准定量法程序操作，得到d，l-HMPAO的含量;所说的标准曲线法为取适量的meso-HMPAO结晶体，配成的标准液，其进样量由小至大依次注入色谱系统，进样两次，取色谱峰积分结果(或测峰高结果)的平均值与进样量制得标准曲线，在同样的色谱条件下，由待测样品溶液的meso-HMPAO色谱峰积分结果(或测峰高结果)，查标准曲线得到meso-HMPAO的含量，最后算出该待测样品的d，l-HMPAO的含量。
4.按照权利要求1或2所述的用色谱法分析某种特定样品的方法，其特征在于使用该方法时所用色谱参数为检测器的紫外波长254nm，灵敏度为0.1AUFS，数据处理机的纸速为1cm/min，色谱柱为μBondapak C18，10μm，φ3.9×300mm，流速为1ml/min，泵压为25kgf/cm2。
全文摘要
用色谱法分析某种特定样品的方法，具体的说是采用反相高效液相色谱法定量分析HMPAO非对映异构体和d，1-HMPAO冻干药盒的方法，包括最佳流动相二氯甲烷、甲醇、乙醇的配制，注入色谱系统，通过紫外检测器后收集，信号送数据处理机，获得所需的结果。该法具有准确、快速、稳定和简便等优点，适于常规质量控制，并已成功地用于HMPAO非对映异构体和d，1-HMPAO冻干药盒的测试。
文档编号G01N30/38GK1072506SQ9210001
公开日1993年5月26日 申请日期1992年1月6日 优先权日1992年1月6日
发明者陈素珍 申请人:中国原子能科学研究院