专利名称：定性和定量测定植物活性多糖高效液相色谱-串联质谱法的制作方法
技术领域：
本发明属于植物及其提取物中活性多糖的定性定量的分析方法，特别涉及一种定性和定量测定植物活性多糖高效液相色谱-串联质谱法。
背景技术：
近年来，多糖类的分析方法主要为高效液相色谱法(HPLC)配以不同的专用色谱检测器来检测的。其中示差检测法是根据试验成分与流动相的折光率差异性来进行检测的。张进杰等(HPLC示差折光法测定水产品中还原糖、磷酸化单糖和蔗糖，食品与生物技术学报，2011，30 (4))通过HPLC示差折光法建立测定水产品中还原糖、磷酸化单糖和蔗糖；施燕支等(HPLC示差折光分析法测定口香糖中的木糖醇等多种糖醇的含量，首都师范大学学报，2005，26 (I))通过HPLC示差折光分析法建立测定口香糖中的木糖醇等多种糖醇的含量的方法。但是示差折光检测灵敏度较低，选择性较差，易受温度和流动相的影响，同时示差折光检测法不能使用梯度洗脱，在进行多组分分析时效果不好。蒸发光散射检测法是基于样品中不挥发分子对光的散射程度与其质量比进行定量的，与其所含基团的性质无关。王培培等(高效液相色谱一蒸发光散射法测定南瓜中果糖、葡萄糖、及蔗糖含量，食品科学，2009，30 (10))将样品用热水提取后，使用Kromasil NH2 (250_X4. 6_，5 μ m)柱分离，以乙腈和水按体积比80:20混合的溶液为流动相，使用蒸发光散射检测器检测，建立测定南瓜中果糖、葡萄糖、及蔗糖含量的高效液相色谱一蒸发光散射法；蔡欣欣等(高效液相色谱蒸发光散射检测法测定食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖，中国卫生检验杂志，2007,17 (6))将样品用水提取、乙腈沉淀，并过C18 SPE柱，以乙腈和水按体积75:25配比混合得到的溶液为流动相，经 A.1ltech Preva ilTM Carbohydrate ES (250X416mm,5 μ m)柱分离，来测定食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖的高效液相色谱蒸发光散射检测方法。但是蒸发光检测器灵敏度较低、不适用于低沸点物质的检测。现今报道的高效液相色谱紫外检测法是基于物 质分子吸收紫外光的原理，通过紫外检测器测定生物矩阵中的单糖和寡糖含量对样品中多糖进行检测的。Peelen GO等(High performance liquidchromatography of monosaccharide and oligosaccharides in a complex biologicalmatrix, Anal Biochem, 1991,198 (2) : 334)认为由于大部分的糖类不具有吸收紫外光基团的特性，该方法通过衍生化，使这些糖类变成具有紫外吸收的基团，从而进行特异性衍生基团的紫外检测。目前最常用的衍生化试剂是伯氨基(Amino Derivatization Reagent),但是，伯氨基试剂衍生有不足之处，首先，生成的希夫氏碱(Schiff Base)须经8h (90°C)的还原反应才可生成稳定的可用于分析的叔胺衍生物；其次，在伯氨基试剂衍生化反应的流程中需要酸催化，反应复杂且时间长，可能导致色谱检测灵敏度降低；另外，伯氨基试剂不能用于还原酮糖的衍生化，使分析结果偏低。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点与不足，提供一种定性和定量测定植物活性多糖的高效液相色谱-串联质谱方法。本发明通过下述技术方案实现一种定性和定量测定植物活性多糖高效液相色谱-串联质谱法，包括以下步骤(I)样品前处理A.固体样品将样品与超纯水按IOmg :1ml混合，充分摇匀，制成待检样液；B.液体样品将样品充分混匀后得到待检样液；(2)衍生化将待检样液、混合多糖溶液以及标准葡萄糖溶液用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)分别进行衍生化处理；(3)质谱定性以AEC衍生化的混合多糖溶液为参照，对AEC衍生化的待检样液进行质谱离子碎片峰的确证，确定还原性多糖的聚合度，对待检样液中所含还原性聚合多糖的种类进行定性；(4) HPLC定量对AEC衍生化的待检样液和AEC衍生化的标准葡萄糖溶液分别进行高效液相色谱分析；用AEC衍生化的标准葡萄糖溶液作为参比，分析制作标准葡萄糖曲线，以此对待检样液中各类还原性聚合多糖进行间接定量； 步骤(I)中所述的样品中的目标检测物为植物或植物提取物中的多糖；步骤(2)中所述的混合多糖优选为Dextran Standard DXTlK Mw1200 ；步骤(2)中所述的3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)衍生化处理的具体步骤如下①将3-氨基-9-乙基咔唑溶解于甲醇中，3-氨基-9-乙基咔唑的终浓度O. 04mol/L，得到AEC甲醇溶液； ②用水配制氰基硼氢化钠，得到浓度为O. 2mol/L的氰基硼氢化钠溶液；③分别在待检样液、混合多糖溶液和标准葡萄糖溶液中加入步骤①制备的AEC甲醇溶液、步骤②制备的O. 2mol/L的氰基硼氢化钠溶液和冰醋酸，其中待检样液、混合多糖溶液和标准葡萄糖分别同AEC甲醇溶液、氰基硼氢化钠溶液和冰醋酸的体积比为10:10:10:3 ;混匀，于70°C水浴加热lh，冷却后加入水，摇匀后，用氯仿进行洗涤，离心，取水相，得到AEC衍生化的待检多糖样液、AEC衍生化的混合多糖溶液和AEC衍生化的标准葡萄糖溶液；步骤③中所述的混合多糖溶液的浓度优选为O. 01mol/L ；步骤③中所述的标准葡萄糖溶液的浓度优选为O. 01mol/L ;标准葡萄糖指的是葡萄糖标准品；步骤②和③中所述的水优选为超纯水；步骤③中所述的洗涤的次数优选为2 3次；步骤③中所述的离心的条件优选为5000rpm/min离心5min ；步骤③中所述的水相需通过过滤纯化；所述的过滤的条件优选为使用O. 45 μ m滤膜过滤；步骤(3)中所述的质谱定性的条件为液相色谱质谱条件，具体如下液相色谱条件为流动相的比例为水相(A)和有机相(B)按体积比70:30配比，其中水相(A)为含O. lmol/L乙酸铵的水溶液，经0. 45 μ m水相滤膜过滤，有机相(B)为纯乙腈；色谱柱为Waters C18 (250X4. 6mm, 5 μ );流速为0. 4mL/min ;柱温为40°C ;进样量为5 20 μ L ;检测波长(UV)为254nm ；
质谱条件离子化模式为电喷雾离子化(ESI);扫描模式为正离子Ql全扫描；离子扫描范围为m/z350 1500 ；步骤(4)中所述的高效液相色谱分析的条件为流动相的比例为水相(A)和有机相(B)按体积比70:30配比，其中水相(A)为含O. lmol/L乙酸铵的水溶液，经O. 45 μ m水相滤膜过滤，有机相(B)为纯乙腈；色谱柱为Waters C18 (250X4. 6mm, 5 μ );流速为O. 4mL/min ;柱温为40°C ;进样量为5 20 μ L ;检测波长(UV)为254nm。本发明的原理本发明利用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)作为衍生化试剂，建立对样品中还原性多糖的简便高效的衍生方法。AEC衍生的机理是多糖的还原端与AEC的伯氨基反应生成烯胺，被氰基硼氢化钠(NaBH3CN)还原为二级胺，使得多糖被AEC标记。衍生化过程仅需I小时，被衍生后的糖类物质疏水性增强，衍生化过程缩短。在反相HPLC分离模式下糖的分离无需专用的糖分析柱，在C18色谱柱上即可得到好的分离效果。经AEC试剂标记后的多糖更容易离子化，使得衍生物的检测信号增强，显著地提高多糖的质谱检测灵敏度。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(I)本发明建立了 3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)柱前衍生化单糖和多糖的高效液相色谱分离及质谱定性定量分析方法，衍生时间仅需I个小时，不但缩短了衍生所需时间，而且提高了质谱检测的灵敏度。(2)本发明的检测灵敏度高、选择性强，多组分同时检测的分离效果好，对专用仪器要求低，样品衍生过程·短。
图1是实施例1中AEC衍生化的待检多糖样品的总质谱离子流图。图2是实施例1中AEC衍生化的待检多糖样品中各不同多糖质谱离子提取图。图3是实施例1中AEC衍生化的混合多糖溶液的质谱离子提取图。图4是实施例1中AEC衍生化的待检多糖样品液相色谱图。图5是实施例1中AEC衍生化的标准葡萄糖液相分离图。图6是实施例2中AEC衍生化的待检多糖样品总质谱离子流图。图7是实施例2中AEC衍生化的待检多糖样品各不同多糖质谱离子提取图。图8是实施例2中AEC衍生化的待检混合多糖溶液的质谱离子提取图。图9是实施例2中AEC衍生化的多糖样品高效液相色谱图
图10是实施例2中AEC衍生化的标准葡萄糖液相分离图。图11是实施例3中AEC衍生化的待检多糖样品的总质谱离子流图。图12是实施例3中AEC衍生化的待检多糖样品各不同多糖质谱离子提取图。图13是实施例3中AEC衍生化的标准葡萄糖质谱图。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1
(I)待检多糖样品为混合植物提取液由银耳、香菇、菊花、桑葚、枸杞子、茯苓、金针菇等天热植物经水提取而得。(2)标准品衍生化处理标准品为Dextran Standard DXTlK Mw1200 (简称为混合多糖对照品，American Polymer Standards公司)和葡萄糖标准品，前者用于定性,后者用于定量。取200 μ L0. Olmol/L的标准品使用溶液于15ml EP管中，依次加入200 μ L含AEC的甲醇溶液(其中AEC的终浓度为O. 04mol/L),200yL0. 2mol/L的氰基硼氢化钠溶液和60 μ L冰醋酸，充分摇匀后于70°C水浴加热lh，拿出冷却至室温后加入500 μ L的超纯水，充分摇勻后加入1. 5mL的氯仿,震荡摇勻后以5000rpm/min转速离心5min,取出静置。吸取上层水相于另一干净的EP管中，用1. 5mL的氯仿重复洗涤2次。将洗涤干净的水相过O. 45 μ m的滤膜后，分别得到AEC衍生化的混合多糖对照品和AEC衍生化的标准葡萄糖，分别10倍稀释后取适量溶液入进样瓶，进行液相和液相质谱分析。(3)样品衍生化处理将混合植物提取液充分摇匀，取200 μ L于15ml EP管中，依次加入200 μ L含AEC的甲醇溶液(其中AEC的终浓度为O. 04mol/L)，200 μ L0. 2mol/L的氰基硼氢化钠溶液和60 μ L冰醋酸，充分摇匀后于70°C水浴加热lh，拿出冷却至室温后加入500 μ L的超纯水，充分摇匀后加入1. 5mL的氯仿，震荡摇匀以5000rpm/min转速离心5min后，取出静置，吸取上层水相于另一干净的EP管中，用1. 5mL的氯仿重复洗涤2次。洗涤干净的水相过O. 45 μ m的滤膜后，10倍稀释后取适量溶液入进样瓶，进行液相和质谱分析。(4)定性测定将步骤(2) AEC衍生化的混合多糖对照品溶液及步骤(3)衍生化处理的样品溶液注入液相色谱质谱仪，按照如下条件进行分析液相色谱条件水相(A):含O. lmol/L乙酸铵的水溶液，经O. 45um水相滤膜过滤；有机相(B):纯乙腈；流动 相比例A:B=70:30 (V/V);色谱柱WatersC18 (250X4. 6mm, 5 μ )；流速0. 4mL/min ;柱温40°C ;进样量:5 20 μ L ;检测波长(UV) :254nm。质谱条件离子化模式电喷雾离子化(ESI);扫描模式正离子Ql全扫描；离子扫描范围m/z350 1500。在样品的离子扫描图中，同时提取其中葡萄糖、双糖、三聚糖、四聚糖、五聚糖、六聚糖、七聚糖的碎片碎片离子峰，质核比分别为375m/z、538m/z、699m/z、86lm/z、1023m/z、1185m/z、1347m/z。得到的结果如图1、2和3所示，通过保留时间及各组分碎片离子特征峰进行定性。(5)定量测定将步骤(2) AEC衍生化的标准葡萄糖溶液和步骤(3)衍生化处理的样品溶液注入高效液相色谱条件中进行测定，得到的结果如图4和5所示。制作标准曲线以AEC衍生化的标准葡萄糖溶液的峰面积为横坐标，标准系列的浓度为纵坐标，作线性回归得标准曲线方程y=lE-05x+0. 52R2=0. 9996。高效液相反相色谱的条件如下水相(A):含O. lmol/L乙酸铵的水溶液，经0. 45um水相滤膜过滤;有机相(B):纯乙腈；流动相比例A:B=70:30 (V/V);色谱柱=Waters C18(250X4. 6mm，5y );流速0· 4mL/min ;柱温40°C ;进样量5 20 μ L ;检测波长(UV)254nm。(6)结果分析如图1 4所示及表1:图1和4中，说明相同洗脱条件下，样品中多糖在紫外检测器和质谱上的保留时间是一致的，保留时间10. 84分钟，分析样品中的多糖峰含有四聚糖，三聚糖，二聚糖，单糖醛酸。糖醛酸相对于相同糖聚合物，保留时间更长，结合混合多糖对照(图3)，判断为九聚糖醛酸；第12. 09分钟，分析样品中多糖峰含有四聚糖，三聚糖，二聚糖，单糖，结合图3的保留时间，判断为七聚糖；在七聚糖后，六聚糖含量少，在13分钟到19分钟，广泛分布戊聚糖，四聚糖，三聚糖，二聚糖，其中三聚糖含量最高，分布见图2。戊聚糖和四聚糖在液相紫外检测信号低，故未定量。定量的结果如表I所示，可见，此方法可简单、快速地测定样品中所含多糖的种类为九聚糖、低聚糖A、低聚糖B、双糖A、双糖B、葡萄糖戊糖、甲基戊糖及相应含量。实施例2(I)待检多糖样品为宝乐果(Borojo)粉将宝乐果去皮去核后加水研磨、经果胶酶酶解后压滤除杂，真空低温浓缩后调节PH，喷雾干燥而成。(2)标准品衍生化处理同实施例1步骤(2)。(3)样品衍生化处理称取IOmg样品于15mL EP管中，往EP管中加入Iml超纯水，充分摇匀，溶解完全后取200 μ L样液于15ml EP管中，其余步骤同实施例1步骤(3)。( 4 )定性测定同实施例1步骤(4 )。得到的结果如图6、7和8所示，通过保留时间及各组分碎片离子特征峰进行定性。(5)定量测定测定条件同实施例1步骤(5)。得到的结果如图9和10所示。制作标准曲线以AEC衍生化的标准葡萄糖溶液的峰面积为横坐标，标准系列的浓度为纵坐标，作线性回归得标准曲线方程y=0. 0196x-0. 4041R2=0. 9999。(6)结果分析见图6 9及表1:在图6和9中，保留时间为10. 2分钟，说明相同洗脱条件下，样品中多糖在紫外检测器和质谱上的保留时间是一致的；分析样品中的多糖峰含七聚糖，结合混合多糖对`照品(图8)，判断为七聚糖；七聚糖后，在10. 6分钟到13分钟，分布着六聚糖、五聚糖、四聚糖，三聚糖，其中三聚糖含量最高，在22分钟到26分钟，分布着半乳糖、葡糖糖和戊糖，分布见图6。定量的结果如表I所示，可见，此方法可简单、快速地测定样品中所含多糖的种类为七聚糖、六聚糖、五聚糖、四聚糖、三聚糖、葡萄糖、戊糖及相应含量。实施例3(I)待检多糖样品为松针提取液将松针粉碎后用水提取而得。(2)标准品衍生化处理同实施例1步骤(2)。(3)样品衍生化处理同实施例1步骤(3)。( 4 )定性测定同实施例1步骤(4 )。得到的结果如图11 13所示，通过保留时间及各组分碎片离子特征峰进行定性。(5)定量测定测定条件同实施例1步骤(5)。制作标准曲线以AEC衍生化的标准葡萄糖溶液的峰面积为横坐标，标准系列的浓度为纵坐标，作线性回归得标准曲线方程y=2. 5e+006x+l. 94e+006R=0. 9996。(6)结果分析如图11 13所示及表1:结合图13，分析图11中保留时间在23. 3分钟的糖峰为葡萄糖。分析图10中离子提取峰，样品中未检出二碳及二碳以上的聚合还原性糖。定量的结果如表I所示，可见此方法可简单、快速地测定样品中所含多糖的种类为葡萄糖及其相应含量多糖名称混合植物提取液ug/ml宝乐果粉(B0R0J0) g/100g松针提取液ug/ml表I混合植物及其提取物中活性多糖含量表
权利要求
1.定性和定量测定植物活性多糖高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于包括以下步骤 (1)样品前处理 A.固体样品将样品与超纯水按IOmglml混合，充分摇匀，制成待检样液； B.液体样品将样品充分混匀后得到待检样液； (2)衍生化将待检样液、混合多糖溶液以及标准葡萄糖溶液用3-氨基-9-乙基咔唑分别进行衍生化处理； (3)质谱定性以AEC衍生化的混合多糖溶液为参照，对AEC衍生化的待检样液进行质谱离子碎片峰的确证，确定还原性多糖的聚合度，对待检样液中所含还原性聚合多糖的种类进行定性； (4)HPLC定量对AEC衍生化的待检样液和AEC衍生化的标准葡萄糖溶液分别进行高效液相色谱分析；用AEC衍生化的标准葡萄糖溶液作为参比，分析制作标准葡萄糖曲线，以此对待检样液中各类还原性聚合多糖进行间接定量。
2.根据权利要求1所述的定性和定量测定植物活性多糖高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于步骤(I)中所述的样品中的目标检测物为植物或植物提取物中的多糖。
3.根据权利要求1所述的定性和定量测定植物活性多糖高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于步骤(2)中所述的混合多糖为Dextran Standard DXTlKMwl200。
4.根据权利要求1所述的定性和定量测定植物活性多糖的高效液相色谱-串联质谱方 法，其特征在于 步骤(2)中所述的3-氨基-9-乙基咔唑衍生化处理的具体步骤如下 ①将3-氨基-9-乙基咔唑溶解于甲醇中，3-氨基-9-乙基咔唑的终浓度O.04mol/L,得到AEC甲醇溶液； ②用水配制氰基硼氢化钠，得到浓度为O.2mol/L的氰基硼氢化钠溶液； ③分别在待检样液、混合多糖溶液和标准葡萄糖溶液中加入步骤①制备的AEC甲醇溶液、步骤②制备的O. 2mol/L的氰基硼氢化钠溶液和冰醋酸，其中待检样液、混合多糖溶液和标准葡萄糖分别同AEC甲醇溶液、氰基硼氢化钠溶液和冰醋酸的体积比为10:10:10:3 ；混匀，于70°C水浴加热lh，冷却后加入水，摇匀后，用氯仿进行洗涤，离心，取水相，得到AEC衍生化的待检多糖样液、AEC衍生化的混合多糖溶液和AEC衍生化的标准葡萄糖溶液。
5.根据权利要求4所述的定性和定量测定植物活性多糖高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于 步骤③中所述的混合多糖溶液的浓度为O. 01mol/L ； 步骤③中所述的标准葡萄糖溶液的浓度为O. 01mol/L ； 步骤②和③中所述的水为超纯水； 步骤③中所述的洗涤的次数为2 3次； 步骤③中所述的离心的条件为5000rpm/min离心5min ； 步骤③中所述的水相通过过滤纯化。
6.根据权利要求5所述的定性和定量测定植物活性多糖高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于所述的过滤的条件为使用O. 45 μ m滤膜过滤。
7.根据权利要求1所述的定性和定量测定植物活性多糖高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于步骤(3)中所述的质谱定性的条件为液相色谱质谱条件，具体如下流动相的比例为水相和有机相按体积比70:30配比，其中水相为含O. lmol/L乙酸铵的水溶液，经O.45 μ m水相滤膜过滤,有机相为纯乙腈；色谱柱为Waters C18 ;流速为O. 4mL/min ;柱温为,40 0C ;进样量为5 20 μ L ;检测波长为254nm ； 质谱条件离子化模式为电喷雾离子化；扫描模式为正离子Ql全扫描；离子扫描范围为 m/z350 1500。
8.根据权利要求1所述的定性和定量测定植物活性多糖高效液相色谱-串联质谱法，其特征在于步骤(4)中所述的高效液相色谱分析的条件为流动相的比例为水相和有机相按体积比70:30配比，其中水相为含O. lmol/L乙酸铵的水溶液，经O. 45 μ m水相滤膜过滤，有机相为纯乙腈；色谱柱为Waters C18 ;流速为O. 4mL/min ;柱温为40°C;进样量为5 ,20 μ L ;检测波长为254nm。
全文摘要
本发明公开了一种定性和定量测定植物活性多糖高效液相色谱-串联质谱法。本发明首先对待检多糖样液、混合多糖溶液以及标准葡萄糖溶液分别进行3-氨基-9-乙基咔唑衍生化处理，得到AEC衍生化的待检多糖、混合多糖溶液以及标准葡萄糖溶液；质谱分析，以AEC衍生化的混合多糖对照为参照，对待检多糖样液进行多糖离子碎片峰的确证，确定还原性多糖的聚合度，对待检多糖中所含还原性聚合多糖的种类进行定性；高效液相色谱分析，用AEC衍生化的标准单糖作为参比，分析制作标准葡萄糖曲线，以此对待检多糖中各类还原性聚合多糖进行间接定量。
文档编号G01N30/02GK103063780SQ201310004268
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月6日 优先权日2013年1月6日
发明者潘若微, 李丹, 胡烨敏, 吴军, 孟平, 王家骥, 陈骁熠 申请人:广州市宜健医学技术发展有限公司