专利名称：聚乙二醇醛衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及聚乙二醇醛，并涉及制备和使用该衍生物的方法，例如在多肽与其它生物分子的聚乙二醇化(pegylation)中。
聚乙二醇是直链或支化的聚醚，可以以各种分子量获得。PEG的结构为HO-(CH2-CH2-O)n-H，其中n表示PEG中环氧乙烷单元的重复数。
PEG和PEG衍生物已经用于改性多种生物分子。当连接到这类分子上时，PEG提高它们的溶解度并增大它们的尺寸，但对期望的性质仅有很小的影响。有利地，与生物分子结合的PEG在体内可以表现出增加的保留和延迟的新陈代谢。
已经为这些应用开发了多种PEG衍生物。这些PEG衍生物例如描述在US5,252,714、US5,672,662、US5,959,265、US5,990,237、US6,340,742中。
已经将两种通用方法用于PEG的官能化(1)通过一系列反应将终端羟基基团改变为更具活性的官能团和/或(2)PEG在受控条件下与双官能化合物反应，以使双官能化合物的官能团之一与PEG聚合物反应而另一个官能团保持活性。在大多数情况下，必须进行若干步骤以获得期望的PEG衍生物。期望的PEG衍生物经常以低收率生产并且需要复杂的纯化过程进行分离。而且，PEG衍生物可能表现出对所关注的生物分子的非特异性连接，这会导致多个PEG连接到单一生物分子上和/或PEG在活性位点上的连接。多重PEG连接会在聚乙二醇化(pegylated)的生物分子的纯化中引起困难。多重PEG连接和/或活性位点上的聚乙二醇化也会导致生物分子活性降低。
因此，提供适合与各种其它分子(包括多肽和其它含α-氨基的生物分子)结合的改良的PEG衍生物会是有利的。仍然需要提供能以高收率和高纯度生产并能结合用以提供具有改善的性能的生物分子的PEG衍生物。
以下更详细地描述本发明的这些和其它目的。
本发明的化合物是聚乙二醇的醛衍生物，具有通式(I)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO(I)其中R1是封端基团，X是O或NH，Y选自 Z是氨基酸的侧链，m为1至17，n为10至10000，p为1至3。
本发明还提供了式(II)的化合物 其中R1、m、n和p定义如上。
本发明的另一优选实施方案提供了一种式(VIII)的双官能聚乙二醇醛化合物 其中R1、m、n和p定义如上。
本发明还提供了式(IX)的中间化合物R1-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)其中R1、X、Y、Z、m、n和p定义如上。
本发明进一步提供了式(X)的中间化合物
其中R1、m、n和p定义如上。
还提供了式(XI)的中间化合物 其中每个m、n和p相同或不同并定义如上。
本发明进一步提供了一种制备聚乙二醇醛的方法，包括水解式(IX)的化合物以生成式(I)的聚乙二醇醛R1-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO (I)其中R1、X、Y、Z、m、n和p定义如上。
如果本发明涉及“制备方法”，也是指“制备过程”。
本发明还提供了一种制备聚乙二醇醛的方法，包括水解式(X)的化合物以生成式(II)的聚乙二醇醛 其中R1、m、n和p定义如上。
本发明提供了一种制备聚乙二醇醛的方法，包括水解式(XVII)的化合物以生成式(VIII)的聚乙二醇醛
其中m、n和p定义如上。
本发明提供了多种化合物和化学中间体以及可用于涉及多肽和其它生物分子的聚乙二醇化的方法。本发明提供了一种新的聚乙二醇醛化学结构。
本发明的化合物是聚乙二醇的醛衍生物，具有通式(I)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO(I)其中R1是封端基团，X是O或NH，Y选自 Z是氨基酸的侧链，m为1至17，n为10至10000，p为1至3。
此处所用的R1“封端基团”是任何适宜的化学基团，取决于优先选择，其对其它化学部份是通常无活性或者通常活性的。上式的终端醛基使其能够容易地共价连接到所关注的化学部份上，例如连接到多肽的α-氨基上。选择R1封端基团以允许或防止双官能度地(例如通过共价键)连接到所关注的第二化学部份上。
在封端基团对其它化学部份通常无活性的情形中，R1是相对惰性的。如果R1是相对惰性的，那么所得聚乙二醇醛的结构是单官能的，并因此仅与一个所关注的化学部份共价键连。适宜的通常无活性的R1封端基团包括氢、羟基、低级烷基、低级烷氧基、低级环烷基、低级链烯基、低级环烯基、芳基和杂芳基。
此处所用的术语“低级烷烃”是指含1至7个、优选1至4个碳原子的取代或未取代的、直链或支化的烷基基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基以及类似物。
术语“低级烷氧基”是指通过氧原子键连的以上定义的低级烷基，低级烷氧基的例子为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基以及类似物。
术语“低级环烷基”是指含3至7个、优选4至6个碳原子的取代或未取代的环烷基基团，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。
此处所用的术语“低级链烯基”是指含2至7个、优选2至5个碳原子的取代或未取代的、直链或支化的链烯基基团，例如乙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基以及类似物。
术语“低级环烯基”是指含4至7个碳原子的取代或未取代的环烯基基团，例如环丁烯基、环戊烯基、环己烯基以及类似物。
术语“芳基”是指苯基或萘基，其为未取代的或可由卤素、低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基、羟基、羧酸、羧酸酯、硝基、氨基或苯基单-或多-取代，特别是由卤素、低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基、羟基、硝基、氨基和苯基取代。
术语“杂芳基”是指含一个或多个选自N、S和O的杂原子的5-或6-员杂芳香族基团。
优选的通常无活性的R1封端基团包括甲氧基、羟基或苄氧基。尤其优选的R1封端基团是甲氧基。当R1是甲氧基时，有时将醛及相关化合物称为“mPEG”化合物，其中m代表甲氧基。
如果R1封端基团与其它化学部份是通常活性的，那么R1是能与一些其它官能团例如肽和蛋白质中的胺和/或巯基反应的官能团。在这种情形下，R1可以是与那些需要强的催化剂或极不切实际的反应条件来进行反应的基团相比，能容易地与其它分子上的亲电或亲核基团反应的官能团。如果R1是相对活性的，那么聚乙二醇醛是双官能的并由此可以与两个化学部份共价键连。
适宜的通常活性的R1封端基团的例子包括卤素、环氧化物、马来酰亚胺、正吡啶基二硫化物(orthopyridiyl disulfide)、甲苯磺酸酯、异氰酸酯、水合肼、氰尿酰卤、N-琥珀酰亚胺氧、磺基-N-琥珀酰亚胺氧、1-苯并三唑氧、1-咪唑氧、p-硝基苯氧、和 术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。
优选的通常活性的R1封端基团为 这种R1基团被用来生成在聚乙二醇醛的两端都带有醛基的聚乙二醇醛。因此，所得聚乙二醇醛在两端都表现出键连特性。然而，应理解这些双官能化合物无需完全对称，并且式中第一m、n和/或p和第二m、n和/或p可以相同或不同。然而优选化合物是对称的，即所述两个m具有相同的值、两个n具有相同的值且两个p具有相同的值、在本发明的化合物中X是O或NH。X优选是O。而且，Y选自 其中Z是氨基酸的侧链。
在本发明中，m为1至17。在一个优选实施方案中，m为1至14。更优选m为1至7，更进一步优选m为1至4。最优选m为1。
在Y基团具有如下通式的情形中
Y基团表现出通过肽键与氨基酸成键。因此，当单个甘氨酸用作氨基酸时，该通式形成简单如下的特定结构 当Z是CH3时，则氨基酸为丙氨酸。如果Z为CH2OH，则氨基酸为丝氨酸。
显然，正如可从对以下各种氨基酸结构的分析所能理解的，当采用更多并且不同的氨基酸时，更复杂的结构也是可能的。优选仅用一种氨基酸。
丙氨酸 精氨酸天冬酰胺 天冬氨酸 半胱氨酸甘氨酸谷氨酰胺 谷氨酸组氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 赖氨酸 蛋氨酸 苯丙氨酸 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸酪氨酸 缬氨酸在本发明中，n为10至10000。在本发明的一个优选实施方案中，n为20至5000。优选地，n为从50至2500，甚至更优选n为从75至1000。最优选n为从100至750。
在本发明中，p为1至3。优选p为3。
在优选实施方案中，p是3、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是2、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是1、R1是甲氧基、m为1且n为100至750。
本发明包括但不限于下式II-VI的化合物的式I的化合物
优选R1封端部份是相对活性的，优选甲氧基、羟基和苄氧基。
本发明优选的化合物落在以上A组的范围内。因此，本发明提供了一种式(II)的化合物 其中R1、m、n和p定义如上。
在一个优选的实施方案中，R1是甲氧基、m为1且n为100至750。更优选地，p是3、R1是甲氧基、m为1且n为100至750。
本发明的另一个优选实施方案提供了一种式(VIII)的双官能聚乙二醇醛化合物 其中m、n和p定义如上。
在一个优选实施方案中，R1是甲氧基、m为1且n为100至750。更优选地，p是3、R1是甲氧基、m为1且n为100至750。
本发明也提供了可以转化为上述本发明的聚乙二醇醛化合物的多种化学中间体。这些中间体包括式(IX)的化合物R1-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)其中R1、X、Y、Z、m、n和p定义如上。
在优选实施方案中，p是3、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是2、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是1、R1是甲氧基、m为1且n为100至750。
本发明进一步提供了式(X)的化合物 其中R1、m、n和p定义如上。
在优选实施方案中，p是3、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是2、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是1、R1是甲氧基、m为1且n为100至750。
还提供了式(XI)的中间化合物
其中每个m、n和p相同或不同并定义如上。
在优选实施方案中，p是3、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是2、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是1、R1是甲氧基、m为1且n为100至750。
本发明的化合物可以用公知的试剂和方法，通过任何适宜的方法制备。然而，本发明提供了一种制备聚乙二醇醛的具体方法，包括水解式(IX)的化合物以生成式(I)的聚乙二醇醛R1-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO(I)其中R1、X、Y、Z、m、n和p定义如上。优选地，水解是酸催化的。适宜的催化用酸包括三氟乙酸、盐酸、磷酸、硫酸和硝酸。优选该酸为三氟乙酸。
在优选实施方案中，p是3、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是2、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是1、R1是甲氧基、m为1且n为100至750。
式(II)的聚乙二醇醛化合物也可以通过任何适宜的方法制备。然而，作为例子，可如下制备式(II)的聚乙二醇醛化合物首先，干燥聚乙二醇。接着，使聚乙二醇与醋酸的卤代衍生物反应。所得反应混合物水解生成PEG羧酸。另外，产物PEG羧酸也可以在干燥步骤后，从PEG的直接氧化得到。接着，用醛二乙缩醛的胺衍生物处理PEG羧酸生成PEG缩醛胺，其与卤代羧酸反应生成式的聚乙二醇醛。然后收集并纯化聚乙二醇醛产物。
可用任何适宜的方法收集和纯化聚乙二醇醛产物。作为例子，可用二氯甲烷萃取聚乙二醇醛产物。将有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并用乙醚沉淀。通过过滤并真空干燥收集产物PEG醛。
由此本发明提供了一种制备聚乙二醇醛的方法，包括水解式(X)的化合物以生成式(II)的聚乙二醇醛 其中R1、m、n和p定义如上。
式(X)的化合物可以通过使式(XII)的化合物与式(XIII)的化合物反应制备R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOH(XII)H2N-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(XIII)另一种制备PEG酸或PEG羧酸的方法是直接氧化法。在这种情形中，可以使用氧化剂例如在钒酸铵或Jone试剂(CrO3和H2SO4)存在下的HNO3、CrO3或K2Cr2O7/H2SO4。
式(XII)的化合物可以通过水解式(XIV)的化合物制备R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOR3(XIV)其中R3是支化或未支化的C1-C4烷基。
式(XIV)的化合物可以通过使式(XV)的化合物与式(XVI)的化合物反应得到R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-OH (XV)R2-(CH2)m-COOR3(XVI)其中R2是卤素。优选R2是溴或氯。适宜的式(XVI)化合物包括溴乙酸叔丁酯、溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、氯乙酸叔丁酯、氯乙酸甲酯和氯乙酸乙酯。适用于此反应步骤，即用来代替式(XVI)的其它试剂，例如为在叔丁醇钾、碱金属氢化物例如氢化钠或萘基钾(potassium naphtalide)存在下的溴乙酸叔丁酯、溴乙酸甲酯、溴乙酸乙酯、氯乙酸叔丁酯、氯乙酸甲酯和氯乙酸乙酯。式(XVI)化合物优选为溴乙酸叔丁酯。
在优选实施方案中，p是3、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是2、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是1、R1是甲氧基、m为1且n为100至750。
式(III)-(VI)的化合物(也分别标识为组B-E)同样可以用任何适宜的方法制备。然而，作为例子可以采用以下反应方案制备(III)-(VI)(组B-E)的化合物。
如上对聚乙二醇醛的论述，双官能聚乙二醇醛可通过任何适宜的方法制造。本发明提供了一种制备聚乙二醇醛的方法，包括水解式(XVII)的化合物以生成式(VIII)的聚乙二醇醛 其中m、n和p定义如上。
式(VI)的化合物可以通过使式(XVIII)的化合物与式(XIX)的化合物反应制备HOOC-(CH2)m-O-CH2CH2-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOH (XVIII)H2N-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(XIX)式(XVIII)化合物可以通过水解式(XX)的化合物得到
R3OOC-(CH2)m-CH2CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOR3(XX)其中R3为支化或非支化的C1-C4烷基。
式(XX)的化合物可以通过使式(XXI)的化合物与式(XVI)的化合物进行反应来制备HO-CH2CH2-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-OH (XXI)R2-(CH2)m-COOR3(XVI)其中R2是卤素。
可将以上论述的本发明的聚乙二醇醛组合物采用任何适宜的方法用于衍生多种分子，包括生物分子。
本发明的PEG醛化合物对于肽和其它生物分子的聚乙二醇化是N-终端位点特异性的。本发明的PEG醛与生物分子或蛋白质的N-终端α-氢基结合，在PEG与生物分子或蛋白质之间形成稳定的次级胺连接。
使用本发明的PEG醛聚乙二醇化的生物分子表现出PEG连接的数量和位置的可重复性，从而使得纯化方案较不复杂。这种位点特异性聚乙二醇化能形成这样的结合，即其中聚乙二醇化位点远离生物分子或肽键连到细胞受体的位点，使得聚乙二醇化的生物分子、蛋白质或肽保持其很多或全部生物活性。本发明的PEG醛能与任何含α-氨基的生物分子反应。
取决于所选择的聚乙二醇醛，聚乙二醇可以共价键连到生物分子的一端(单官能聚乙二醇醛)或两端(双官能聚乙二醇醛)。
如所述的，本发明的聚乙二醇醛可用于N-终端位点特异性聚乙二醇化。位点特异性N-终端连接形成了聚乙二醇化的多肽，避免了单一多肽的交联和多重衍生。为形成这种位点特异性共价连接，可以任何采用适宜的反应条件。通常，反应混合物的pH对于活化待聚乙二醇化的多肽的α-氨基酸而言足够酸性。典型地，pH为约5.5至约7.4，优选约6.5。
因此，一种将聚乙二醇分子连接到多肽上的方法包括使至少一种式(XXII)的多肽与式(I)的聚乙二醇醛分子反应以制备式(XXIII)的化合物
NH2B (XXII)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO(I)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-NHB(XXIII)式(I)中R1、X、Y、Z、m、n和p定义如上；式(XXIII)中聚乙二醇醛分子与所提供的多肽的N-终端氨基键连。
在优选实施方案中，p是3、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是2、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是1、R1是甲氧基、m为1且n为100至750。
式(XXII)的化合物可以是任何多肽，包括干扰素-α、干扰素-β、consensus interferon、红细胞生长素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(包括IL-2、IL-10、IL-12)以及集落刺激因子。
式(XXII)的化合物也可以是免疫球蛋白，例如lgG、lgE、lgM、lgA、lgD、其亚型及其片段。术语“抗体”或“抗体片段”是指多克隆和单克隆抗体、完整的免疫球蛋白或抗体或与目的抗原结合的免疫球蛋白分子的任何功能片段。该抗体片段的例子包括Fv(可变片段)、单链Fv、互补决定簇(CDR)、VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、Fab(抗原结合片段)、F(ab)2’，及其任何组合或能与目的抗原结合的免疫球蛋白肽的其它任何官能团。
如所述的，可以任何期望的方式制备聚乙二醇化的化合物。应当选择有利于α-氨基位点特异性聚乙二醇化的条件，例如pH。
通常，可以通过以1∶1至1∶100的摩尔比添加式(XXII)的化合物和PEG试剂使多肽与本发明的聚乙二醇化合物聚乙二醇化。然后可将反应浓缩物置于室温或4摄氏度、pH为5.5至9.0的硼酸盐、磷酸盐或tri缓冲液中约.5至24小时。PEG试剂与肽/蛋白质的摩尔比通常为1∶1至100∶1。肽/蛋白质的浓度通常为1至10mg/ml。缓冲液的浓度通常为10至500mM。
可以任何期望的方式分离和纯化聚乙二醇化的化合物。作为例子，所得反应混合物可用平衡缓冲液(20mM Tris，pH 7.5)稀释，然后将所得化合物加到Q-Sepharose柱上。在将混合物加到QA柱上之后，用平衡缓冲溶液洗涤用75M的NaCl洗脱、用200mM的NaCl洗脱、用1M NaCl洗脱、再用1M HOAC+1M NaCl和0.5NaOH再生。通过使用反相HPLC，可以从混合物中的其它副产物中分离并分出N-终端单聚乙二醇化的产物。然后可用基质辅助激光脱附/飞行质谱的离子化时间(Matrix AssistedLaser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry)(MALDI-TOF)确认收集的每种产物。
在本发明聚乙二醇化方法的一个优选实施方案中，式(XXII)的多肽与式(II)的聚乙二醇醛分子反应以制备式(XXIV)的化合物NH2B (XXII)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-CO-NH-(CH2)p-CHO(II)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-CO-NH-(CH2)p-NHB(XXIV)式(II)中R1、m、n和p定义如上；式(XXIV)中聚乙二醇醛分子与多肽的N-终端氨基连接。
在优选实施方案中，p是3、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是2、R1是甲氧基、m为1且n为100至750；或p是1、R1是甲氧基、m为1且n为100至750。
本发明化合物用途的其它说明披露在共同提交的美国专利申请中，即2002年7月24日提交、美国序列号No.60/398,195、题为“聚乙二醇化的T20多肽”；2002年7月24日提交、美国序列号No.60/398,190、题为“聚乙二醇化的T1249多肽”以及2003年1月10日提交、美国序列号No.60/439,213、题为“聚乙二醇化的T20多肽”，此处将其全文引入作为参考。
本发明进一步提供了一种将聚乙二醇分子连接到多肽上的方法，包括使式(XXII)的多肽与式(VIII)的聚乙二醇醛分子反应以制备式(XXV)的化合物
NH2B(XXII) 式(VIII)中每个m、n和p相同或不同并且定义如上；式(XXV)中聚乙二醇醛分子与多肽的N-终端氨基键连。
在优选实施方案中，p是3、m为1且n为100至750；或p是2、m为1且n为100至750；或p是1、m为1且n为100至750。
可以任何期望的方式使用聚乙二醇化的多肽。然而，适宜的是通过与制药上可接受的的赋形剂混合，将其用于制备药物组合物。这些药物组合物可以是单位剂量的形式。它们可以是可注射的溶液或悬浮液、透皮给药装置或任何其它期望的形式。
以下实施例旨在进一步描述本发明。这些实施例仅用于说明而不希望以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例1.PEG醛化合物的制备将50至100ml甲苯中的5克PEG(分子量1000至60000道尔顿)通过回流共沸干燥1至3小时，接着除去20至30ml甲苯。将所得溶液冷却至室温，然后将在20-50ml绝对叔丁醇与20-50ml甲苯中的叔丁醇钾(过量1至10摩尔)加入该PEG溶液。随后在氩气氛中在室温下搅拌所得混合物两小时。
用注射器将溴乙酸叔丁酯(过量1至10摩尔)加入反应中，在氩气氛中在室温下搅拌反应混合物过夜。取决于所期望的式(XVI)中定义的“m”基团的大小，可用另一种乙酸(例如丙酸、丁酸等)的卤代衍生物代替溴乙酸叔丁酯。
然后通过旋转蒸发浓缩反应溶液，通过加入乙醚使剩余物沉淀。滤出并在真空中干燥沉淀产物PEG羧基叔丁酯。
然后将PEG羧基叔丁酯(4g)溶解在50-100ml 1N氢氧化钠中，在室温下搅拌溶液过夜。加入1至6N盐酸调节混合物的pH至2.5至3.0，并用二氯甲烷萃取混合物。然后将有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并沉淀到乙醚中。通过过滤和在真空下干燥收集产物PEG羧酸。
然后将PEG羧酸(3g)溶解在无水二氯甲烷(20-30ml)中，随后加入4-氨基丁醛二乙缩醛(过量1-5摩尔)、1-羟基苯并三唑(过量1-5摩尔)和二环己基碳二亚胺(过量1-5摩尔)。取决于式(XIII)中定义的“p”基团的期望的大小，可用另一种醛二乙缩醛的胺衍生物，例如3-氨基丙醛二乙缩醛或2氨基乙醛二乙缩醛，代替4-氨基丁醛二乙缩醛。
在氩气氛中在室温下搅拌所得混合物过夜。将反应混合物过滤、浓缩、用2-丙醇与乙醚(1∶1)的混合物沉淀。真空干燥PEG缩醛产物过夜。
然后将PEG缩醛产物溶解在10-200ml 1-90％的CF3COOH中，在室温下搅拌溶液过夜。加入1N NaOH溶液调节混合物的pH值至6.0，然后加入氯化钠(10重量％)，再加入1N NaOH溶液调节混合物的pH值至7.0。随后用二氯甲烷萃取混合物。将有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并用乙醚沉淀。通过过滤和真空干燥收集产物PEG醛。
实施例2.mPEG10k-丁醛的制备以下代表制备本发明mPEG10k-丁醛(mPEG10k-butanoaldehyde)的总体反应方案
mPEG10k-丁醛的反应方案 首先，将300ml甲苯中的分子量为10000道尔顿的羧甲基PEG(30.0g，3mmol)通过回流共沸干燥2小时，接着除去100ml甲苯。将所得溶液冷却至室温，然后将在20ml绝对叔丁醇与20ml甲苯中的叔丁醇钾(0.68g，6mmol)加入PEG溶液(1)。在氩气氛中在室温下搅拌所得混合物两小时。
用注射器将溴乙酸叔丁酯(1.00ml，6.75mmol)加入反应中，在氩气氛中在室温下搅拌反应混合物过夜。然后通过旋转蒸发浓缩反应溶液，加入乙醚使剩余物沉淀。滤出并在真空中干燥沉淀的产物。产量28g。NMR(d6-DMSO)1.40ppm(t，9H，-CH3)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.50ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.96ppm(s，2H，-O-CH2-COO-)。
接着，将mPEG10k羧甲基叔丁酯(20g)溶解在200ml 1N氢氧化钠中，在室温下搅拌溶液过夜(2)。加入6N盐酸调节混合物的pH至2.5，并用二氯甲烷(50ml、40ml和30ml)萃取混合物。然后将有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并用乙醚沉淀。通过过滤和在真空下干燥收集产物m-PEG10k-羧甲基酸。产量18g。NMR(d6-DMSO)3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.99ppm(s，2H，-O-CH2-COOH-)。
然后将mPEG10k-羧甲基酸(3g，0.3mmol)溶解在无水二氯甲烷(20ml)中，随后加入4-氨基丁醛二乙缩醛(50mg，0.3mmol)、1-羟基苯并三唑(40mg，0.3mmol)和二环己基碳二亚胺(80mg，0.39mmol)(3)。在氩气氛中在室温下搅拌所得混合物过夜。将反应混合物过滤、浓缩、用2-丙醇与乙醚(1∶1)的混合物沉淀。真空干燥mPEG10k丁醛二乙缩醛产物过夜。产量2.7g。NMR(d6-DMSO)1.07-1.12ppm(t，6H，-(-O-CH2-CH3)2)；1.46ppm(m，4H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.08-3.11ppm(q，2H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O-)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；4.44ppm(t，1H，-NHCH2CH2CH2-CH-)；7.67ppm(-NH-)。
最后，将mPEG10k丁醛二乙缩醛(5g，0.5mmol)溶解在50ml 10％CF3COOH中，在室温下搅拌溶液过夜(4)。加入1N NaOH溶液调节混合物的pH值至6.0，然后加入氯化钠(10重量％)，再加入1N NaOH溶液调节混合物的pH值至7.0。随后用二氯甲烷萃取混合物。将有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并沉淀到乙醚中。通过过滤和真空干燥收集产物mPEG10k-丁醛(5)。产量4.1g。NMR(d6-DMSO)3.21ppm(s，-OCH3)；3.5ppm(s，-O-CH2CH2-O)；3.85ppm(s，2H，-O-CH2-CO-NH-)；7.67ppm(-NH-)；9.66ppm(-CHO-)。
实施例3.mPEG10k-缩醛醛的制备通过将按照实施例1中的步骤制备的mPEG10k-醛二乙缩醛(1g，分子量10000)溶解在10ml 80％三氟乙酸(Aldrich，99+％)中制备mPEG10k-缩醛醛。在氩气氛中在室温下搅拌反应溶液过夜。然后滴加1N NaOH到反应溶液中直到获得6.0的pH值。接着，将NaCl(10重量％)加到以上溶液中，然后加入1N NaOH调节pH至6.95±0.05。接着用二氯甲烷萃取溶液。将有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并用乙醚沉淀。通过过滤和真空干燥收集产物mPEG10k-缩醛醛。产量0.85g(85％)。
实施例4.mPEG10k-丙醛的制备通过将按照实施例1中的步骤制备的mPEG10k-丙醛乙缩醛(2g，分子量10000)溶解在20ml 80％三氟乙酸(Aldrich，99+％)中制备mPEG10k-丙醛。在氩气氛中在室温下搅拌反应溶液过夜。然后滴加1N NaOH到反应溶液中直到获得6.0的pH值。接着，将NaCl(10重量％)加到以上溶液中。然后加入1N NaOH调节pH至6.95±0.05。接着用二氯甲烷萃取溶液。将有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并用乙醚沉淀。通过过滤和真空干燥收集产物mPEG10k-丙醛。产量1.8g(90％)。
实施例5.PEG20k-二丁醛的制备通过将按照实施例1中的步骤制备的PEG20k-二丁醛二乙缩醛(3.1g，分子量20000)溶解在20ml 80％的三氟乙酸(Aldrich，99+％)中制备PEG20k-二丁醛。在氩气氛中在室温下搅拌反应溶液过夜。然后滴加1NNaOH到反应溶液中直到获得6.0的pH值。接着，将NaCl(10重量％)加到以上溶液中。然后加入0.1N NaOH调节pH至6.95±0.05。接着用二氯甲烷萃取溶液。将有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并用乙醚沉淀。通过过滤和真空干燥收集产物PEG20k-二丁醛。产量2.5g(81％)。
实施例6.mPEG20k-丁醛的制备通过将按照实施例1中的步骤制备的mPEG20k-丁醛二乙缩醛(3.0g，分子量20000)溶解在30ml 80％的三氟乙酸(Aldrich，99+％)中制备PEG20k-丁醛。在氩气氛中在室温下搅拌反应溶液过夜。然后滴加1N NaOH到反应溶液中直到获得6.0的pH值。接着，将NaCl(10重量％)加到以上溶液中。然后加入1N NaOH调节pH至6.95±0.05。接着用二氯甲烷萃取溶液。将有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并用乙醚沉淀。通过过滤和真空干燥收集产物mPEG20k-丁醛。产量2.5g(83.3％)。
实施例7.mPEG20k-丁醛的制备通过将按照实施例1中的步骤制备的mPEG20k-丁醛二乙缩醛(14.7g，分子量20000)溶解在200ml 10％的三氟乙酸(Aldrich，99+％)中制备PEG20k-丁醛。在氩气氛中在室温下搅拌反应溶液过夜。然后滴加1N NaOH到反应溶液中直到获得6.0的pH值。接着，将NaCl(10重量％)加到以上溶液中。然后加入0.1N NaOH调节pH至6.95±0.05。接着用二氯甲烷萃取溶液。将有机层用硫酸钠干燥、过滤、浓缩并用乙醚沉淀。通过过滤和真空干燥收集产物mPEG20k-丁醛。产量13.1g(89％)。
权利要求
1.一种式(I)的化合物R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO (I)其中R1是封端基团，X是O或NH，Y选自 Z是氨基酸的侧链，m为1至17，n为10至10000，以及p为1至3。
2.权利要求1所述的化合物，其中R1选自卤素、环氧化物、马来酰亚胺、正吡啶基二硫化物、甲苯磺酸酯、异氰酸酯、水合肼、氰尿酰卤、N-琥珀酰亚胺基氧、磺基-N-琥珀酰亚胺基氧、1-苯并三唑基氧、1-咪唑基氧、p-硝基苯基氧、和
3.权利要求1所述的化合物，具有式(III)
4.权利要求1所述的化合物，具有式(IV)
5.权利要求1所述的化合物，具有式(V)
6.权利要求1所述的化合物，具有式(VI)
7.权利要求1所述的化合物，具有式(II) 其中R1是封端基团，m为1至17，n为10至10000，且p为1至3。
8.权利要求7所述的化合物，其中p为3。
9.权利要求7所述的化合物，其中p为3，R1是甲氧基，m为1且n为100至750。
10.一种式(VIII)的化合物 其中m为1至17，n为10至10000，且p为1至3。
11.一种式(IX)的化合物R1-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)其中R1是封端基团，X是O或NH，Y选自 Z是氨基酸的侧链，m为1至17，n为10至10000，且p为1至3。
12.一种式(X)的化合物 其中R1是封端基团，m为1至17，n为10至10000，且p为1至3。
13.一种式(XI)的化合物 其中m为1至17，n为10至10000，且p为1至3。
14.一种制备聚乙二醇醛的方法，包括水解式(IX)的化合物以生成式(I)的聚乙二醇醛R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(IX)R1-(CH2CH2O)n-CH2CH2-X-Y-NH-(CH2)p-CHO(I)其中R1是封端基团，X是O或NH，Y选自 Z是氨基酸的侧链，m为1至17，n为10至10000，且p为1至3。
15.一种制备聚乙二醇醛的方法，包括水解式(X)的化合物以生成式(II)的聚乙二醇醛 其中R1是封端基团，m为1至17，n为10至10000，且p为1至3。
16.权利要求15所述的方法，其中式(X)的化合物通过使式(XII)的化合物与式(XIII)的化合物反应制备R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOH(XII)H2N-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(XIII)
17.权利要求16所述的方法，其中式(XII)的化合物通过水解式(XIV)的化合物制备R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOR3(XIV)其中R3是支化或未支化的C1-C4烷基。
18.权利要求17所述的方法，其中式(XIV)的化合物通过式(XV)的化合物与式(XVI)的化合物的反应制备R1-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-OH(XV)R2-(CH2)m-COOR3(XVI)其中R2是卤素。
19.一种制备聚乙二醇醛的方法，包括水解式(XVII)的化合物以生成式(VIII)的聚乙二醇醛 其中m为1至17，n为10至10000，且p为1至3。
20.权利要求19所述的方法，其中式(VIII)的化合物通过式(XVIII)的化合物与式(XIX)的化合物的反应制备HOOC-(CH2)m-O-CH2CH2-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOH (XVIII)H2N-(CH2)p-CH-(OCH2-CH3)2(XIX)
21.权利要求20所述的方法，其中式(XVIII)化合物通过水解式(XX)的化合物制备R3OOC-(CH2)m-CH2CH2-O-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-O-(CH2)m-COOR3(XX)其中R3为支化或非支化的C1-C4烷基。
22.权利要求21所述的方法，其中式(XX)的化合物通过式(XXI)的化合物与式(XVI)的化合物的反应来制备HO-CH2CH2-(CH2-CH2-O)n-CH2CH2-OH(XXI)R2-(CH2)m-COOR3(XVI)其中R2是卤素。
全文摘要
本文提供了聚乙二醇醛化合物。还提供了制备和使用这类化合物的方法以及化学中间体。
文档编号C08G65/331GK1671769SQ03817649
公开日2005年9月21日 申请日期2003年7月16日 优先权日2002年7月24日
发明者C-Y·王 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司