3，4－二羟基苯甲醛及其衍生物在治疗乙型肝炎及病毒感染性疾病中的新用途的制作方法

专利名称：3，4－二羟基苯甲醛及其衍生物在治疗乙型肝炎及病毒感染性疾病中的新用途的制作方法
专利说明3，4-二羟基苯甲醛及其衍生物在治疗乙型肝炎及病毒感染性疾病中的新用途 本发明涉及3，4-二羟基苯甲醛在治疗乙型肝炎及病毒感染性疾病中的新用途，3，4-二羟基苯甲醛衍生物及含3，4-二羟基苯甲醛衍生物的组合药物。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)引起的一种严重的传染性疾病。乙型肝炎是我国最重要的疾病之一。目前，我国有乙型肝炎病毒携带者约1.2亿，慢性乙型肝炎患者3000多万人。乙型肝炎病毒感染者中约80％的人有不同程度的肝损害，且有相当数量的患者衍变为重症型肝病、肝硬化及肝癌。所以，近几十年以来，人们一直寻找治疗或预防乙型肝炎的药物，并已开发出一些治疗或预防乙型肝炎的药物，如化学药物如阿糖腺苷单磷酸，无环鸟苷，苏拉明，奎诺酮类药物，中国传统中草药的有效成份如苦参碱、甘草甜素、猪苓多糖、香菇多糖等，生物制剂如干扰素，白介素-2等。但这些药物由于副作用或使用不方便，尤其是停药后病毒水平反跳等原因，尚不能达到令人满意的治疗效果，对HBV的预防虽有疫苗可应用，但现有疫苗的预防免疫失败率为10％左右，加上尚未普及乙肝疫苗的预防接种，每年依然新增数百万新的乙肝患者。因此，寻找和开发新的抗HBV药物具有重大的社会和经济效益。至今为止，还没有发现任何关于3，4-二羟基苯甲醛及其衍生物(即化合物0412及其衍生物)在治疗乙型肝炎及病毒感染性疾病中的报道。本实验室经过对丹参各种单体的反复筛选，并通过细胞水平的反复验证，从而完成了本发明。本发明目的就是提供一类以3，4-二羟基苯甲醛及3，4-二羟基苯甲醛为母核的衍生物治疗乙型肝炎及病毒感染性疾病的新的抗乙肝药物。
本发明的第一个目的涉及式(I)化合物0412的取代衍生物
(I)其中R1为氢，C1-6烷基，C1-6卤原子取代烷基；R2和R3可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基，C1-6酰基，卤原子取代C1-6酰基，咖啡酰基，3，4-二羟基苯甲酰基，绿原酰基，奎宁酰基。
本发明的第二个目的涉及式(II)的化合物0412的酯类衍生物 (II)其中R1为C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基，碱金属M，M选自碱金属如Na，K等；R2，R3可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基，C1-6酰基，卤原子取代C1-6酰基，咖啡酰基，3，4-二羟基苯甲酰基，绿原酰基，奎宁酰基。
本发明的第三个目的涉及式(III)化合物0412的缩醛类衍生物 (III)其中R1和R2可以相同或不同，分别C1-6烷基，C1-6卤原子取代烷基；R3，R4可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基，C1-6酰基，卤原子取代C1-6酰基，咖啡酰基，3，4-二羟基苯甲酰基，绿原酰基，奎宁酰基。
本发明的第四个目的涉及式(IV)化合物0412的酰胺类衍生物
(IV)其中R1、R2可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，C1-6羟基取代的烷基，C1-6卤原子取代的烷基；R3，R4可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基，C1-6酰基，卤原子取代C1-6酰基，烷基咖啡酰基，3，4-二羟基苯甲酰基，绿原酰基，奎宁酰基。
本发明的第五个目的涉及式(V)化合物0412的希夫氏碱类衍生物 (V)其中n＝1～12；R1为氢，羟基，烷氧基，烷胺基，卤原子；R2，R3可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基，C1-6酰基，卤原子取代C1-6酰基，咖啡酰基，3，4-二羟基苯甲酰基，绿原酰基，奎宁酰基。
化合物0412的取代衍生物，化合物0412的酯类衍生物，化合物0412的缩醛类衍生物，化合物0412的酰胺类衍生物以及希夫氏碱类衍生物，在治疗乙型肝炎等病毒性感染性疾病中的用途；以及上述化合物与核苷类似物抗病毒药物联用，在治疗乙型肝炎等病毒性感染性疾病中的用途。
根据本发明，本发明的药物可以按本领域已知方法配成，片剂，胶囊，粒剂，注射液等。
本发明的实施对严重危害人类健康的乙型肝炎及其相关疾病的治疗具有重要的社会效益和经济效益。


图1化合物0412对HepG2.2.15细胞增值的影响图2化合物0412对HepG2.2.15细胞中HBV DNA的抑制作用图3化合物0412停药后对HBsAg抑制作用的反跳试验图4化合物0412停药后对HBeAg抑制作用的反跳试验图5化合物0412对拉米夫定抑制HBsAg的增效作用图6化合物0412对拉米夫定抑制HBeAg的增效作用图7化合物0412对鸭体内的HBeAg和HBsAg的抑制作用[具体实施方式
]以下通过以下实施例来阐述本发明所述各种化合物的制备方式，以及根据体内，体外各种实验，对化合物0412及其衍生物抗HBV作用进行评价。化合物0412的取代衍生物的制备(以3，4-二苯甲酰氧基苯甲醛为例)冰盐浴下以二氯甲烷为溶剂，加入化合物0412及三乙胺溶解，然后搅拌下滴入苯甲酰氯，维持温度在5℃以下，滴完后继续搅拌若干小时；依次用水、稀盐酸、水、碳酸氢钠溶液、水洗涤；无水硫酸钠干燥过夜；减压浓缩得粗品；乙醇水重结晶；干燥得产品。其它C1-6酰基、咖啡酰基、绿原酰基等化合物同上述方法合成。化合物0412的酯类衍生物的制备(以3，4-二苯甲酰氧基苯甲酸乙酯为例)3，4-二苯甲酰氧基苯甲酸、无水乙醇在酸性条件下加热，乙醇水重结晶，干燥得产品。其它成酯反应均可以通过该方法制得，其它位的基团引入见化合物0412的取代衍生物的制备。化合物0412的缩醛类衍生物的制备(以3，4-二苯甲酰氧基苯甲醛缩乙二醇为例)3，4-二苯甲酰氧基苯甲醛溶于无水甲苯中，加入乙二醇及催化剂量对甲基苯磺酸，在Dean-Stark装置下回流若干小时；旋转蒸去溶剂；乙醇水重结晶；干燥得产品。其它缩醛基团的合成方法与此类似；其它位的基团引入见化合物0412的取代衍生物的制备。化合物0412的酰胺类衍生物的制备(以3，4-二羟基苯羟亚胺为例)化合物0412与氨基乙醇加热溶于无水乙醇中；加入少量丙酮和石油醚；加热回流1～3小时，减压浓缩得产品，其它酰胺类基团的合成方法与此类似；其它位的基团引入见化合物0412的取代衍生物的制备。化合物0412的希夫氏碱类衍生物的制备(以3，4-二羟基苯甲酰-6′-羟己胺为例)化合物0412、DMF、羰基二咪唑、二异丙基乙胺混合，加热于40～50℃反应2小时后，加6-氨基己醇室温搅拌过夜，将反应液倒入水中，析出固体，抽滤，干燥得产品。其它希夫氏碱类的合成方法与此类似；其它位的基团引入见化合物0412的取代衍生物的制备。化合物0412的体外抗乙肝病毒作用材料与方法1.Hep2.2.15细胞培养Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Invitrogen)及380μg/mlG418的MEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态良好，培养至对数生长期后，将Hep2.2.15细胞接种96孔板，0.75×105细胞/孔，37℃，5％CO2孵育72小时，待长至40～60％细胞汇合后，进行给药实验。
2.化合物0412作用结果的处理与统计化合物0412对HBeAg、HBsAg的抑制百分率(％)计算抑制百分率IR(％)＝(A490对照-A490给药)/A490对照*100抑制百分率IR(％)＝(A450对照-A450给药)/A450对照*100IC50半数抑制剂量，用于描述化合物0412对HBV病毒分泌合成HBeAg、HBsAg的抑制作用TC50半数有毒剂量，用于描述化合物0412对HepG2.2.15细胞增殖的抑制作用。
IC50、TC50具体计算方法，以吸光值A或抑制率与浓度的对数用四参数Logistic函数拟合作图，曲线形状若为典型的S型浓度—效应曲线，可以得到在不同浓度处理时抗原生成量酶联免疫(ELISA)检测测定的吸光值A的最大值(Emax)和最小值(Emin)，最高抑制率、最低高抑制率、抑制50％所需浓度(IC50)和斜率(Hill’s系数)。IC50w为抑制曲线中最重要的参数，它代表抑制抗原合成或分泌所需的药物浓度，在曲线斜率相同的条件下，显然浓度越低表示药物抑制活性越高。抑制率与药物浓度转化为两参数的Logit作图法作图若为直线，可以在图上直接读出IC50。IC50＝10(截距/斜率)。
3.化合物0412对HepG2.2.15细胞增值的影响Hep2.2.15细胞在含10％胎牛血清(Gibco)及380μg/ml G418的MEM培养基中，于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养至对数生长期后，接种96孔板，0.75×105细胞/孔，37℃，5％CO2孵育72小时，待长至40-60％细胞汇合后，将化合物0412以2倍稀释的13个浓度分别给药，每浓度3孔，同时设无药物细胞对照和阳性对照，37℃，5％CO2培养，每3天更换原浓度的药液培养，6天观察结果。
参照MTS(Promega)使用说明书，每孔加入MTS 20μl/100μl培养液，避光37℃，5％CO2培养1.5小时，在多标记检酶联免疫检测仪(VICTORTMWallac 1420Multilabel Counter，Finland)上测定450nm处吸光值A。
4.化合物0412对Hep2.2.15细胞分泌HBsAg，HBeAg的抑制作用检测化合物0412以2倍稀释的9个分别处理Hep2.2.15细胞，同时以抗乙肝药物拉米夫定作为阳性对照，以不加药物组作为空白对照组。每浓度3孔，37℃，5％CO2培养，共9天，每三天更换原浓度药液培养，收集细胞培养液。
取收集好的细胞培养液，按照HBsAg，HBeAg酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(华美公司)说明书操作步骤检测，在多标记检酶联免疫检测仪(VICTORTMWallac 1420Multilabel Counter，Finland)上测定450nm处吸光值A。
5.化合物0412对Hep2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用检测化合物0412以2倍稀释的9个浓度分别处理Hep2.2.15细胞，同时以不加药物组作为空白对照组。每浓度3孔，37℃，5％CO2培养，共6天，每三天更换原浓度药液培养，收集细胞培养液。
取第6天的细胞培养液，100℃煮沸15min，12000r/min离心10min，取上清作为荧光定量PCR的模板，实验过程按乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光检测试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司)说明书操作步骤进行，取2μl模板加入到反应管中，混匀后将各反应管与标准曲线反应管一起放入iCycle自动PCR仪中进行扩增，扩增条件为94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共40个循环，反应结束后由iCycle软件自动计算出定量结果。
6.化合物0412停药后对HBsAg、HBeAg抑制作用的反跳检测化合物0412以2倍稀释的9个浓度分别处理Hep2.2.15细胞，以拉米夫定作为阳性对照，以不加药物组作为空白对照组，每浓度3孔，37℃，5％CO2培养，共6天，每三天更换原浓度药液培养，第6天收集细胞培养液，按照酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(华美公司)说明书操作检测HBsAg、HBeAg，同时改换为等体积的细胞培养液，37℃，5％CO2培养3天，收集细胞培养液，按照酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(华美公司)说明书操作检测HBsAg、HBeAg。
7.化合物0412对拉米夫定抑制HepG2.2.15细胞合成、分泌HBsAg、HBeAg的增效作用化合物0412以5个浓度(3μg/ml、6μg/ml、12μg/ml、24μg/ml、48μg/ml)分别与拉米夫定的4个浓度(0.2μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml)根据析因实验设计相组合，联合给药，每种浓度重复4孔，同时设单用化合物0412及单用拉米夫定作为对照组，以不加药物组作为空白对照组。37℃，5％CO2培养，共3天，收集细胞培养液。按照酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(华美公司)说明书操作检测HBsAg、HBeAg。
结果表1.化合物0412在Hep2.2.15培养中对HBeAg和HBsAg合成和分泌的抑制作用(表内数据均值±标准差，n＝3)
*和**与同一培养时间不加药细胞组比较P＜0.05或P＜0.01#和##不加药正常细胞组不同培养时间比较P＜0.05或P＜0.01
1.化合物0412对HepG2.2.15细胞增值的影响化合物0412以2倍稀释为浓度梯度的13个浓度处理HepG2.2.15细胞过程中，每日在倒置显微镜下观察细胞形态，加药组细胞形态与对照组细胞形态没有明显的变化。实验独立重复三次，MTS检测结果见图1。计算化合物0412对HepG2.2.15细胞的半数有毒剂量TC50＝146.16μg/ml，以小于TC50值3倍的剂量做为检测抑制乙肝病毒活性的最大给药剂量。
2.化合物0412对Hep2.2.15细胞分泌HBeAg和HBsAg的抑制作用化合物0412以2倍稀释为浓度梯度的9个浓度处理HepG2.2.15细胞，37℃，5％CO2培养，共9天，每三天更换原浓度药液培养，收集细胞培养液，按照酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(华美公司)说明书操作检测HBsAg、HBeAg。实验独立重复三次，具体实验化合物0412的抑制作用见表1。化合物0412对HBeAg的抑制作用的IC50为2.1μg/ml，对HBsAg的抑制作用的IC50为1.89μg/ml，到第6天时药物的抑制作用达到最大，之后药物的抑制作用不再随作用时间延长而变化。
3.化合物0412对Hep2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用化合物0412以2倍稀释为浓度梯度的9个浓度分别处理Hep2.2.15细胞，同时设立细胞对照组，6天后收集细胞培养液，荧光定量PCR检测化合物0412各浓度对Hep2.2.15细胞分泌HBV DNA的抑制作用。实验独立重复三次，结果图2。从图2的数据可以看出化合物0412在12～48μg/ml浓度下可以有效抑制Hep2.2.15细胞分泌合成HBV DNA，计算出化合物0412抑制乙肝分泌合成HBV DNA的IC50＝15.18μg/ml。
4.化合物0412停药后对HBsAg、HBeAg抑制作用的反跳检测分别检测化合物0412和拉米夫定给药后第6天的HBsAg与HBeAg的抑制率，以及停药后三天各自HBsAg与HBeAg的抑制率。实验独立重复三次，结果见图3和图4。由图可见，拉米夫定在停药后3天，各个浓度下，对HBsAg和HBeAg均有不同程度的反跳。而化合物0412在高浓度(24μg/ml、48μg/ml)时，对HBsAg和HBeAg抑制作用几乎没有降低，故停药后，乙肝病毒水平几乎不发生反跳。
5.化合物0412对拉米夫定抑制HepG2.2.15细胞合成、分泌HBsAg、HBeAg的增效作用化合物0412与拉米夫定联合用药处理HepG2.2.15细胞，37℃，5％CO2培养，第三天更换原浓收集细胞培养液，按照酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(华美公司)说明书操作检测HBsAg、HBeAg。化合物0412的抑制作用见图5和图6。从图中可以看出，化合物0412在拉米夫定低浓度时对HBsAg和HBeAg都有较好的增效作用，可以降低拉米夫定的用药剂量。化合物0412各衍生物的体外抗病毒作用具体实施步骤同实施例6，通过体外细胞学生物实验，以权利要求中所述的化合物0412为母核的一系列衍生物均有一定的抗病毒作用，以各类衍生物中取代表化合物表示该类衍生物在体外抗病毒作用，各代表化合物对Hep2.2.15细胞合成和分泌HBeAg、HBsAg和HBV DNA具有较强的抑制作用的IC50值和对，对HepG2.2.15细胞的增殖的抑制作用TC50值的平均值见表2。化合物0412的在鸭体内的抗乙肝病毒作用材料与方法表2各代表化合物对Hep2.2.15细胞合成和分泌HBeAg、HBsAg和HBV DNA具有较强的抑制作用的IC50值和对，对HepG2.2.15细胞的增殖的抑制作用TC50值(μg/ml)
1.鸭乙肝模型建立孵出24小时内的北京鸭，由足静脉注射上海麻鸭DHBV DNA阳性血清，每只0.2ml，感染7天后取躯血，分离血清，按照酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(华美公司)说明书操作检测HBsAg、HBeAg。
2.化合物0412对鸭体内的HBeAg和HBsAg的抑制作用DHBV感染雏鸭7天后，化合物0412按50、12.5和5mg/kg给药(口服)，以拉米夫丁50mg/kg口服为阳性对照，以生理盐水作为阴性对照。分别在用药后第3天，第6天，第9天，第12天和停药后第3天，第6天足静脉取血，分离血清按照酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(华美公司)说明书操作检测HBsAg、HBeAg。
结果检测结果见图7，从图7可以看出在用药后第6天，化合0412的抑制作用达到其最佳抑制效果，且停药后无明显的反跳作用。
结论化合物0412及其衍生物对Hep2.2.15细胞合成和分泌HBeAg、HBsAg和HBV DNA具有较强的抑制作用，且在给定浓度下对Hep2.2.15细胞增殖无明显抑制作用，尤其是在停药后，可使乙肝病毒水平几乎不发生反跳，若将化合物0412及其衍生物与拉米夫定联合用药，化合物0412及其衍生物在拉米夫定低浓度时对HBsAg和HBeAg都有较好的增效作用，可以降低拉米夫定的用药剂量。化合物0412对鸭体内的HBeAg和HBsAg的也有较强的抑制作用。
权利要求
1.下式(I)原儿茶醛的取代衍生物 其中R1为氢，C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基；R2和R3可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基，C1-6酰基，卤原子取代C1-6酰基，咖啡酰基，3，4-二羟基苯甲酰基，绿原酰基，奎宁酰基。
2.下式(II)的原儿茶醛的酯类衍生物 其中R1为C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基，碱金属M，M选自碱金属如Na，K等；R2，R3可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基，C1-6酰基，卤原子取代C1-6酰基，咖啡酰基，3，4-二羟基苯甲酰基，绿原酰基，奎宁酰基。
3.下式(III)原儿茶醛的缩醛类衍生物 其中R1和R2可以相同或不同，分别C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基；R3，R4可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基，C1-6酰基，卤原子取代C1-6酰基，咖啡酰基，3，4-二羟基苯甲酰基，绿原酰基，奎宁酰基。
4.下式(IV)原儿茶醛的酰胺类衍生物 其中R1、R2可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，C1-6羟基取代的烷基，C1-6卤原子取代的烷基；R3，R4可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，C1-6卤原子取代的烷基，C1-6酰基，卤原子取代C1-6酰基，咖啡酰基，3，4-二羟基苯甲酰基，绿原酰基，奎宁酰基。
5.下式(V)原儿茶醛的希夫氏碱类衍生物 其中n＝1～12；R1为氢，羟基，烷氧基，烷胺基，卤原子；R2，R3可以相同或不同，分别为氢，C1-6烷基，卤原子取代C1-6烷基，C1-6酰基，卤原子取代C1-6酰基，咖啡酰基，3，4-二羟基苯甲酰基，绿原酰基，奎宁酰基。
6.权利要求1-5项以原儿茶醛为母核的化合物，在制备治疗乙型肝炎等病毒性感染性疾病的药物中的用途。
7.根据权利要求6的用途，其中权利要求1的优先基团为R1，R2和R3均为氢，即3，4-二羟基苯甲醛。
8.一种用于治疗乙型肝炎及病毒感染性疾病的药物组合物，其特征在于以权利要求1-5所述的任一化合物作为治疗性成分以及必要的药用赋性体或载体。
9.权力要求8的药物组合物或各单体与核苷类似物抗病毒药物联用，在治疗乙型肝炎等病毒性感染性疾病中的用途。
10.权力要求8的药物组合物，其中所述药物组合物或各单体可被配制成片剂，胶囊，注射液或其它剂型。
全文摘要
本发明涉及原儿茶醛的取代衍生物，原儿茶醛的酯类衍生物，原儿茶醛的缩醛类衍生物，原儿茶醛的酰胺类衍生物以及希夫氏碱类衍生物，在治疗乙型肝炎等病毒性感染性疾病中的用途；以及上述药物组合物或各单体与核苷类似物抗病毒药物联用，在治疗乙型肝炎等病毒性感染性疾病中的用途。
文档编号C07C49/84GK1683303SQ20051005521
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月15日 优先权日2005年3月15日
发明者王升启, 张毅, 周喆, 杨静, 伯晓晨, 李鲁, 丁晓然, 娄绍科 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所