专利名称：：用液相层析-质谱法分析体液内的氨基酸的制作方法
技术领域：
：本发明一般涉及氨基酸，特别是包含在生物学流体内的氨基酸的检测和分析。背景由于许多原因，患者体液(例如，血浆)内的氨基酸的身份和数量对于患者的健康是重要的。异常氨基酸水平能用于诊断疾病或病变。例如，低血浆氨基酸水平可以发生在患有癌症、厌食症、关节炎、毛囊炎、酗酒、胰高血糖素瘤和/或怀孕的患者体内。经历重压或抑郁的患者也可以具有低的血浆氨基酸水平。特别地，抑郁患者可能缺乏苯丙氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、色氨酸和/或牛磺酸。精神病患者可能具有低水平的氨基酸如甘氨酸、色氨酸和/或组氨酸，和升高水平的氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和/或丝氨酸。患有传染病和/或发热的患者也可以具有降低的氨基酸水平，尽管在这样的患者体内的一些氨基酸如苯丙氨酸可以以升高水平存在。肾衰竭患者可以具有低水平的氨基酸如酪氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸和/或组氨酸。患有克罗恩病(Crohn'sdisease)、溃疡性结肠炎、慢性疲劳综合征的患者血浆中可以异常地具有低水平的胱氨酸和谷氨酰胺。此外，高于正常的氨基酸水平也许是疾病状态的指示。例如，升高的血浆氨基酸水平可以在患有肝脏疾病、胰腺炎、重金属中毒、维生素C缺乏和/或维生素D缺乏的患者体内被观察到。特别地，威尔逊病(Wilson'sdisease)患者可以显示升高的色氨酸和组氨酸水平。患有库兴病(cushing'sdisease)或痛风的患者可以显示升高的丙氨酸水平。糖尿病患者可以显示升高水平的缬氨酸、亮氨酸和/或异亮氨酸。多动儿童可以显示升高水平的酪氨酸和苯丙氨酸。槭糖尿病(M即leSyrupUrineDisease)患者血浆中可以具有升高水平的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸。因此，分析体液如血浆中的氨基酸的方法在医学和科学情形(settings)中是有用的。传统上，氨基酸的分析方法已经包括了衍生化步骤。在衍生化过程中，氨基酸与促进样品中的氨基酸分析的衍生化试剂发生反应。衍生化试剂通常与样品中氨基酸的游离氨基发生反应。用于衍生化氨基酸的常见试剂包括异硫氰酸酯(例如，苯基异硫氰酸酯(PITC))、邻苯二醛(0PA)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)和Na-(2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(alainamide)(FDAA)。衍生化试剂是有用的，因为它们可以包括促进衍生化氨基酸的分析的取代基。例如，衍生化试剂可以包括用于UV-吸收检测的生色团或用于荧光检测的荧光团。通过进行与质谱连接的层析如液相层析(LC)或气相层析(GC)(即，LC-MS或GC-MS)，可以分离和检测衍生化氨基酸。但是，氨基酸具有不同的化学结构(例如，碱性的、酸性的、芳香族的、极性的、非_极性的等)，并且由于可能存在于体液中的各种氨基酸在化学结构上的重大差异，这些化合物给分析者提出了解决LC-MS或GC-MS中衍生/分离的艰巨任务。使用LC和MS检测氨基酸的方法已经被报导过，包括，例如，Casetta等人，〃Developmentofamethodforr邻idquantificationofaminoacidsby4liquidchromatrogr即hy，tandemmassspectrometry〃(1X-MSMS)inplasma〃ClinChemlabMecK2000)38:391-401;Hess等人，〃Acidhydrolysisofsilkfibroinsanddeterminationoftheenrichmentofisotopicallylabeledaminoacidsusingprecolumnderivitizationaridhighperform肌celiquidchromatogr即hy-electrsp:rayionizationmassspectrometry〃AnalBiochem(2002)311:19-26;Ji等人，〃Determinationofphenethylisothiocyanateinhumanplasmaandurinebyammoniaderivatizationandliquidchromatogr即hy-tandemmassspectrometry"AnalBiochem(2003)323:39-47;VanEijik等人，〃Determinationofaminoacidisotopeenrichmentusingliquidchromatogr即hy-massspectrometry"(1999)AnalBiochem271:8-17;禾口Liu等人，〃DerivitizationofaminoacidswithN，N_dimethyl_2，4_dinitro_5_fluorobenzylamineforliquidchromatogr即hy/electrosprayionizationmassspectrometry"(2004)RapidCommunMassSpectrom18:1059-65。检测体液内氨基酸的改进方法是令人期望的。发明概述公开的是检测可能存在于个体的体液内的各种个体氨基酸的方法。体液内的个体氨基酸的检测可以用于确定体液是否包含异常的一个或多个氨基酸。一方面，该方法包括衍生化体液氨基酸，通过液相层析(LC)分离衍生化氨基酸，用质谱(MS)分析鉴定衍生化氨基酸，以及通过与来自一系列氨基酸标准物的结构上相近的氨基酸的比较来量化衍生化氨基酸。优选地，MS不同于串联MS，其包括，例如，单一MS。结构上相似的氨基酸共有重要的结构特征如关键的官能团，以便使用质谱法鉴定一个氨基酸能够以同样的方法用于鉴定其它结构上相似的氨基酸。通过在处理之前添加一系列个体氨基酸标准物到体液中，该系列个体氨基酸标准物优选地用作一系列内标。适合的体液包括，例如，血浆、血清、唾液、尿液和脑脊髓液(CSF)。对于检测、鉴定和/或量化血浆中个体氨基酸的方法，其水平可以与表1中提供的参考范围相比较。落在表1的参考范围之外的血浆氨基酸水平可以被鉴定为异常。对于检测、鉴定和/或量化尿液中个体氨基酸的方法，其水平可以与表2中提供的参考范围相比较。落在表2的参考范围之外的尿液氨基酸水平可以被鉴定为异常。对于检测、鉴定和/或量化CSF中个体氨基酸的方法，其水平可以与表3中提供的参考范围相比较。处于表3的参考范围之外的CSF氨基酸水平可以被鉴定为异常。对于检测、鉴定和/或量化唾液中个体氨基酸的方法，其水平可以与表4中提供的参考范围相比较。处于表4的参考范围之外的唾液氨基酸水平可以被鉴定为异常。在一些实施方式中，每个氨基酸的参考范围基于对象(即，婴儿、幼儿、儿童或成人)的年龄而不同。该系列标准物可以是非_衍生化的，并在衍生化之前添加到初始体液中或任何后处理步骤中。在优选的实施方式中，该标准物包含个体氖化氨基酸(即，包含一个或多个氖离子的单个氨基酸)。该系列标准物也可以在衍生化步骤之后添加到体液氨基酸中。在这种情况下，添加的标准物应该以与体液氨基酸同样的方式被衍生化。在一种方法中，该氨基酸用异硫氰酸酯(例如，苯基异硫氰酸酯(PITC))衍生化。在优选的实施方式中，衍生化试剂是PITC。其它适合的衍生化试剂可以包括邻苯二醛(0PA)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)和Na-(2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(FDAA)。每个来自一定量体液的鉴定的氨基酸的数量，能通过将其质谱信号与已知数量的结构相似的氨基酸的信号相比较来确定。然后体液中氨基酸的数量可以相对于分析的体液的体积表示，以获得原始体液内氨基酸的浓度。定量分析优选地用内标进行。在一些实施方式中，在进一步分析之前，体液可以被处理以获得具有浓縮的氨基酸浓度的部分。在一种方法中，获得了体液的低分子量部分(例如，使体液通过分子量滤器获得)。在一个实施方式中，该方法可以用于检测至少20个不同的个体氨基酸。在其它实施方式中，该方法可以用于检测至少25、30、35或40个个体氨基酸。例如，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述个体氨基酸包括但不限于磷酸丝氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、磷酸乙醇胺(PEA)、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、肌氨酸、牛磺酸、肌肽、瓜氨酸、精氨酸、鹅肌肽、1_甲基_组氨酸、3_甲基_组氨酸、a_氨基_己二酸(AAD)、苏氨酸、丙氨酸、e-丙氨酸(BALA)、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸(GABA)、P-氨基-异丁酸(BAIB)、a-氨基-丁酸(AAB)、半胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、L-别-胱硫醚(胱硫醚-A)、L-胱硫醚(胱硫醚-B)、胱氨酸、异亮氨酸、别_异亮氨酸、亮氨酸、DL-羟赖氨酸(羟赖氨酸(1))、DL-别-羟赖氨酸(羟赖氨酸(2))、苯丙氨酸、鸟氨酸、色氨酸、高胱氨酸、精氨琥珀酸(ASA)、赖氨酸和Hawkinsin((2-L-半胱氨酸-S-基_1，4_二羟基环己-5-烯-1-基)-乙酸)。此外，基于任何检测到的体液内个体氨基酸的水平，该方法可以用于诊断疾病状态。在一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于天冬氨酸、ASA、S-半胱氨酸、谷氨酸、OH-脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、PEA、AAD、甘氨酸、谷氨酰胺、肌氨酸、组氨酸、13-丙氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、肌肽、苏氨酸、精氨酸、鹅肌肽、1-甲基_组氨酸、3_甲基-组氨酸、丙氨酸、GABA、BAIB、脯氨酸、乙醇胺、AAB、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱硫醚A、胱硫醚B、胱氨酸、异亮氨酸、别-异亮氨酸、亮氨酸、羟基_赖氨酸_1、羟基_赖氨酸-2、高胱氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鸟氨酸和赖氨酸。在另一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于羟脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、肌氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、精氨酸、1，3-甲基-组氨酸、a-氨基-己二酸、苏氨酸、丙氨酸、e-丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、e-氨基-异丁酸、a-氨基-丁酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、L-胱硫醚、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、色氨酸、高胱氨酸和赖氨酸。仍在另一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于羟脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、肌氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、精氨酸、1，3_甲基_组氨酸、a_氨基_己二酸、苏氨酸、丙氨酸、e-丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、e-氨基-异丁酸、a-氨基_丁酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸丄-胱硫醚、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、色氨酸、高胱氨酸、赖氨酸、胱氨酸和羟赖氨酸。仍在另一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于羟脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、6甘氨酸、组氨酸、肌氨酸、牛磺酸、瓜氨酸、精氨酸、a-氨基-己二酸、苏氨酸、丙氨酸、e-丙氨酸、脯氨酸、Y_氨基_丁酸、P_氨基_异丁酸、a_氨基_丁酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、鸟氨酸、色氨酸、高胱氨酸和赖氨酸。在一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于磷酸丝氨酸、磺酸_半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、l，3-甲基-组氨酸、a-氨基-己二酸、P-丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y_氨基_丁酸、P_氨基_异丁酸、半胱氨酸丄_别_胱硫醚_A、L-胱硫醚、胱氨酸、别_异亮氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。在另一个实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于磷酸丝氨酸、磺酸_半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3-甲基_组氨酸、a_氨基_己二酸、13-丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y_氨基_丁酸、13_氨基_异丁酸、半胱氨酸、L-别-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。在进一步的实施方式中，该方法可以用于鉴别半胱氨酸、磷酸丝氨酸或精氨琥珀酸中的任一种。在进一步的实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于磷酸丝氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3-甲基-组氨酸、a_氨基_己二酸、13-丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y_氨基_丁酸、P_氨基_异丁酸、半胱氨酸、L-别-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、别_异亮氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。在进一步的实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于磷酸丝氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3_甲基_组氨酸、a_氨基_己二酸、乙醇胺、Y_氨基_丁酸、P_氨基_异丁酸丄-别-胱硫醚_A、L-胱硫醚、胱氨酸、别_异亮氨酸JL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。在进一步的实施方式中，该方法可以用于检测和/或量化个体氨基酸的任何组合，所述氨基酸包括但不限于磷酸丝氨酸、半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3_甲基-组氨酸、a-氨基-己二酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、P_氨基_异丁酸丄-别-胱硫醚_A、L-胱硫醚、胱氨酸、0卜羟赖氨酸JL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。在其它实施方式中，该方法量化至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少七个、至少十个、至少十五个、至少二十个、至少二十五个或至少三十个或更多个个体氨基酸。该公开的方法可以用作诊断或监测对多种已知与异常个体氨基酸(S卩，除二肽和多肽之外的单个氨基酸)水平有关的疾病的治疗效果的基础。例如，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸和/或组氨酸的水平可以用于诊断和/或监控肾衰竭；胱氨酸和/或谷氨酰胺可以用于诊断和/或监控克罗恩病、溃疡性结肠炎和/或慢性疲劳综合征；色氨酸和/或组氨酸可以用于诊断和/或监控威尔逊病；丙氨酸可以用于诊断和/或监控库兴病或痛风；缬氨酸、亮氨酸和/或异亮氨酸可以用于诊断和/或监控糖尿病和/或槭糖尿病；酪氨酸和/或苯丙氨酸可以用于诊断和/或监控机能亢进失调(hyperactivitydisorder);和hawkinsin可以用于诊断和/或监控乙酸尿(霍金斯素尿症，hawkinsi皿ria)。可以用任何类型的、如商业上可得的LC系统来进行衍生化氨基酸的LC分离。适合的LC柱是具有包含微小颗粒(例如，具有直径大约为2-5m，优选地大约为3ym的二氧化硅颗粒)的填装材料的柱子。颗粒通常具有大约50到300埃，并且优选地大约为150埃的孔。颗粒通常具有大约50-600m2/g的表面积，优选地大约100m2/g的表面积。颗粒可以包括连接在其表面的疏水固定相。在一个实施方式中，疏水固定相可以是烷基相，其可以包括C_4、C-8和C-18(优选地是C-18)。柱子可以具有任何适当的尺寸。优选地，柱子具有的直径大约为O.5毫米到大约5毫米，并且长度大约为15毫米到大约300毫米，并且最优选地，直径大约2毫米，长度大约50毫米。衍生化氨基酸的LC分离也可以用疏水溶剂或梯度中包括疏水溶剂的溶剂混合物作为流动相来进行以洗脱氨基酸。在一个实施方式中，衍生化部分可以被施加到水性缓冲液(即，亲水溶剂)中的柱子上，并且可以通过施加流动相到具有渐增数量的有机溶剂(即，疏水溶剂)的柱子中来洗脱氨基酸。例如，水性缓冲液可以包括(95%水，5%乙腈)，且可以通过逐渐增加流动相中乙腈的浓度到大约100%，从柱子上洗脱氨基酸。如果期望，流动相可以被加热到温度大约为40-6(TC，优选地大约为50°C。此外，流动相可以任选地包括一个或多个在LC和/或MS期间有用的额外试剂。例如，乙酸铵或乙酸。衍生化氨基酸的MS分析可以通过样品的电离来进行。适合的电离技术包括电喷雾电离(electrosprayionization)(ESI)、大气压化学电离(APCI)、光电离(photoinonization)、电子电离、快速原子轰击(FAB)/液相二次电离(liquidsecondaryionization)(LSMS)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子喷镀电离和粒子束电离。优选地，使用ESI进行MS。进一步地，可以用阴离子或阳离子模式进行MS，优选地是阴离子模式。衍生化氨基酸的MS分析可以用几种类型的离子分析器中的任一种进行，所述离子分析器包括四极分析器、离子阱分析器和时间飞行分析器。优选地，可以使用四极分析器进行MS。可以通过使用包括选择性离子检测模式(SIM)和扫描模式在内的几种检测模式对MS期间产生的离子进行检测。优选地，用SIM检测离子。MS优选地不是串联MS。也提供的是诊断个体内代谢失调——包括氨基酸代谢——的存在的方法。该方法包括通过下述步骤确定体液是否包含异常水平的一个或多个氨基酸首先(a)衍生化体液氨基酸；(b)用液相层析(LC)分离衍生化氨基酸；(c)使用质谱仪，对分离的衍生化氨基酸进行质谱分析(MS);和(d)通过与来自一系列氨基酸标准物的结构相似的氨基酸相比照，使用MS分析来鉴定来自体液的衍生化氨基酸的量。该方法的各种实施方式与那些已经讨论过的相似。附图简述图1是显示用本文描述的方法检测和量化的各种氨基酸的表。第三列显示丽"分子量"；第四列显示PITC分子量；第五列显示每种PITC衍生化氨基酸的分子量；第六列是LC保留时间；第七列显示观察到的质谱离子。图2显示了包含指定氨基酸的单个样品的在LC分离之前的MS分析结果。指出了每个氨基酸的离子尺寸特征。优选实施方式详述如本文所用的，"氨基酸"是指含有共价地连接氨基和酸基的a-碳原子的任何分子。酸基可以包括羧基。"氨基酸"可以包含具有下式之一的分子其中R是侧基，并且Z包含至少3个碳原子。"氨基酸"包括但不限于二十种内源的人类氨基酸及其衍生物如赖氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、磷酸丝氨酸(PSER)、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸(ASA)、羟脯氨酸、磷酸乙醇胺(PEA)、肌氨酸(SARC)、牛磺酸(TAU)、肌肽(CARN)、瓜氨酸(CIT)、鹅肌肽(ANS)、1，3-甲基-组氨酸(ME-HIS)、a-氨基-己二酸(AAA)、P-丙氨酸(BALA)、乙醇胺(ETN)、Y_氨基_丁酸(GABA)、P-氨基-异丁酸(BAIA)、a_氨基_丁酸(BABA)、L-别-胱硫醚(胱硫醚-A;CYSTA-A)、L_胱硫醚(胱硫醚-B;CYSTA-B)、胱氨酸、别-异亮氨酸(同种异体-ILE)、DL-羟赖氨酸(羟赖氨酸(1))、DL-别-羟赖氨酸(羟赖氨酸(2))、鸟氨酸(0RN)、高胱氨酸(HCY)以及它们的衍生物。"氨基酸"也包括立体异构体如D-氨基酸和L-氨基酸形式。除非明确地另外指明，术语"氨基酸"指除了存在于二肽、多肽和蛋白质中的氨基酸之外的个体(即，游离)氨基酸分子。如本文所用的，"体液"意思是能从个体的身体分离出来的任何流体。例如，"体液"可以包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、眼泪、汗液、脑脊髓液(CSF)等。优选地体液是血浆、血清、脑脊髓液、尿液或唾液，其中血浆是最优选的。如本文所用的，"衍生化"意思是使两个分子发生反应形成一个新分子。例如，氨基酸可以通过使该氨基酸与衍生化剂发生反应而被衍生化，形成衍生化氨基酸。衍生化可以包括使氨基酸的a氨基与衍生化剂的亲电子原子发生反应形成共价键。衍生化剂可以包括异硫氰酸酯基团、二硝基_氟苯基基团、硝基苯氧基羰基和/或邻苯二醛基团。如本文所用的，"液相层析"(LC)意思是当流体均一地渗透穿过细粒状物质的柱子，或通过毛细管通道时，选择性地延迟一种或多种流体溶液的组分的过程。延迟是混合物组分在一个或多个固定相和大量流体(即，流动相)之间分配的结果，因为该流体逆向移动到固定相。该过程用于分析和分离两种或多种物质的混合物。"液相层析"包括反相液相层析(RPLC)和高压液相层析(HPLC)。如本文所用的，"质谱"分析或"质谱法"(MS分析)意指鉴别未知化合物的分析技术，其包括(l)电离化合物并潜在地分馏化合物以形成带电荷的化合物；和(2)检测带电荷化合物的分子量并计算质荷比(m/z)。该化合物可以通过任何适合的方式电离和检测。"质谱仪"包括电离化合物并检测带电荷化合物的装置。如本文所用的，"电喷雾电离"意指在质谱法中使用的、电离大分子并克服大分子变成碎片的倾向的技术。在"电喷雾电离"中，液体被载气推动通过非常小的带电荷的金属毛细管。液体包括待研究的物质、分析物以及通常比分析物更具挥发性的大量的溶剂。包含在毛细管中的电荷被转移到使分析物分子带电荷的液体中。因为相似电荷互相排斥，所以液体将自己推出毛细管并形成薄雾或大约lOym直径的小液滴气溶胶，以增加相似的带电荷分子间的距离。中性载气被用来蒸发小液滴中的中性溶剂，这反过来使带电荷的分析物分子相互更加靠近。但是，分子的接近变得不稳定，并且由于带相似电荷的分子相互更加靠近，液滴再一次爆炸。该过程自己重复直至分析物不含溶剂并形成纯的离子。纯离子被传输到质谱分析器。如本文所用的，"四极分析器"是由四极杆(即，两对金属杆平行排列)组成的质谱分析器，其中一对杆处于正电势而另一组杆处于负电势。为了被检测到，离子必须通过接近并平行于排列的杆的轨道路线中心。当四极杆以给定的直流电振幅和射频电压操作时，只有给定m/z比的离子会共振并具有稳定的轨道以通过四极杆并被检测到。"阳离子模式"意指其中带正电荷离子被质谱分析器检测到的模式。"阴离子模式"意指在其中带负电荷离子被质谱分析器检测到的模式。对于"单一离子监控"或"选择性离子监控"(即，SIM)，直流电的振幅和射频电压被设定为只观察特定的质量。如本文所用的，"低分子量部分"是富集一种或多种低分子量分子的部分。低分子量分子通常具有低于大约1000道尔顿的分子量，并且最典型的低于大约500道尔顿。如本文所用的，"疏水的"意指不溶解或微溶于水。"疏水的"化合物包括长链烷烃。疏水溶剂是能够溶解疏水化合物的溶剂。如本文所用的，"大约"用在数字的情形中意指该数字加上或减去10%。公开的是鉴定和/或量化体液内氨基酸的方法。体液可以是血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、脑脊髓液等。优选的体液是血浆、血清、CSF、尿液或唾液，最优选的是血浆。—系列代表可能存在于特定体液内的氨基酸类型的个体氨基酸标准物在任何处理过程之前被优选地加到体液样品中。该系列氨基酸标准物优选地包含存在于该系列中的已知数量的每种个体氨基酸。一系列氨基酸标准物可以包括一个或多个来自如下的氨基酸赖氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸、磷酸丝氨酸、磺酸_半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、牛磺酸、肌肽、瓜氨酸、鹅肌肽、l，3-甲基-组氨酸、a-氨基-己二酸、e-丙氨酸、乙醇胺、Y-氨基_丁酸、P_氨基_异丁酸、a_氨基_丁酸、L-别-胱硫醚(胱硫醚-A)、L_胱硫醚(胱硫醚-B)、胱氨酸、别-异亮氨酸、亮氨酸、DL-羟赖氨酸(羟赖氨酸(1))、DL-别-羟赖氨酸(羟赖氨酸(2))、鸟氨酸、色氨酸、高胱氨酸和它们的异构体(例如，立体异构体)。该系列氨基酸标准物的氨基酸可以被修饰以便它们能容易地与体液内发现的相应的氨基酸区别开来。内标氨基酸优选地表现出最接近这样的氨基酸——所述氨基酸被选择以在化学上和物理上代表，但是在质谱分析时分裂为不同质量的离子。因而，优选的氨基酸系列标准物被氖化。体液可以在衍生化之前被处理以获得富集的氨基酸制备物。取决于体液的类型，不同的方法可以用于该目的。这些方法包括过滤、沉淀、离心及其结合等。低分子量部分的分离是优选的方法。小体积样品的颗粒离析(粒析，sizes印aration)优选地通过使用低分子量截止滤器(cutofffilter)过滤来进行。过滤的体液样品(即，渗透物)将包括游离氨基酸，而保留的组分(即，保留物)将包括高分子量组分如蛋白质。用于产生过滤物的适合的滤器包括45微米、22微米和100000、50000及10000道尔顿的截止滤器。此外，可通过向样品中添加醇(例如，甲醇)或酸使高分子量组分从血浆样品中沉淀出来。也可以通过高速离心将高分子量组分从样品中除去。氨基酸的衍生化在任何必要的对体液样品的处理之后进行。样品中的氨基酸通常被衍生化以促进在LC-MS期间(例如，前置柱(预柱，precolumn))衍生化首先进行，随后进行LC)样品中游离氨基酸的分离和/或检测。衍生化剂可以包括在层析法期间或之后促进衍生化氨基酸的检测的物质(例如，荧光团或生色团)。此外，衍生化剂可以包括在质谱法期间促进衍生化氨基酸电离的物质。典型的衍生化剂包括异硫氰酸酯(例如，苯基异硫代氰酸酯(PITC))、邻苯二醛(0PA)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)和Na-(2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(FDAA)。在优选的实施方式中，衍生化剂是PITC。在样品中的氨基酸被衍生化之后，对样品进行层析分离，优选地是高压液相层析分离，和质谱法(g卩，LC-MS)。液相层析法和质谱法可以通过将衍生化样品放进包括与质谱仪流体连通的层析柱的仪器中进行。层析柱通常包括介质(即，装填材料)以促进衍生化氨基酸的分离(即，分馏)。介质可以包括具有直径大约为2-6iim的、优选地是3iim的细小颗粒。例如，颗粒可以是二氧化硅颗粒。颗粒可以具有直径大约为50-300埃、优选地是150埃的孔。此外，颗粒可以具有大约50-600m7g、优选地100m7g的表面积。颗粒包括与衍生化氨基酸相互作用的键合表面以促进氨基酸的分离。一种适合的键合表面是疏水的键合表面如烷基键合表面。烷基键合表面可以包括C-4、C-8或C-18键合烷基基团、优选地是C-18键合基团。柱子可以有任何适合的尺寸。特别地，柱子可以具有大约0.5-5毫米的直径，大约15-300毫米的长度。优选地，柱子具有直径大约2毫米，长度大约50毫米。用于制备层析柱的适合的介质和/或制备好的柱子可以从商业化来源获得。特别地，适合的柱子可以从ThermoelectronCorporation获得(例如，250X2.l线5um，BBasicC18柱子)。层析柱包括用于接收样品的入口和用于释放包括分馏样品的流出物的出口。在该方法中，衍生化样品被施加到柱子入口处，用溶剂或溶剂混合物洗脱，并在出口处释放。可以选择不同的溶剂模式来洗脱氨基酸。例如，液相层析法可以用梯度模式、恒溶剂模式或多型(polytyptic)(即，混合)模式进行。优选地，液相层析法用梯度模式进行。在梯度模式中，衍生化样品被施加到柱子，并且两种溶剂的混合物(即，流动相)通过柱子中以洗脱氨基酸。一般地，如本领域所知的，溶剂之一将趋向于相对地亲水，而另一溶剂将趋向于相对地疏水。作为被发现适合于本方法的实践的溶剂组合的具体实例，亲水溶剂可以是95%水、5%乙腈，而疏水溶剂可以是100%的乙腈。任选地，溶剂的组合可以包括促进衍生化氨基酸的分离和/或检测的一种或多种试剂(例如，20mM乙酸铵)。一些试剂可以被添加到流动相中以改进色谱峰的形状和/或提供LC-MS离子源。在大部分情况下，为了用梯度溶剂实施液相层析法，使用两种泵来混合两种溶剂。最初，当溶剂被混合时，流经柱子的溶剂混合物(即，流动相)包括大部分亲水溶剂。逐渐地，混合物中亲水溶剂的数量减少，而混合物中疏水溶剂的数量增加，以产生溶剂梯度。最后，通过柱子的溶剂混合物包括大部分疏水溶剂。以这种方式，亲水氨基酸将在疏水氨基酸之前被洗脱。质谱仪包括接收分馏样品的入口，其与层析柱的出口流体连通。质谱仪能够产生11一个或多个质谱数据组，用于鉴定样品中的一种或多种氨基酸。进行LC-MS的适合的仪器可以从商业来源获得。特别地，进行LC-MS的适合的仪器可以从AgilentTechnologies获得(例如，Agilent1100SeriesLC/MSD)。质谱仪将包括离子源，其用于电离分馏的样品并产生带电荷的分子以进行进一步分析。样品的电离可以通过电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(ACPI)、光电离、电子电离、快速原子轰击(FAB)/液相二次电离(LSIMS)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷涂/等离子喷镀电离和粒子束电离来进行。优选的是电雾化电离。样品被电离后，可以分析因此产生的带正电荷或负电荷的离子，以确定质荷比(即，m/z)。优选地，分析带负电荷离子。适合的用于确定质荷比的分析器包括四极杆分析器、离子阱分析器和时间飞行分析器。优选地，使用四极杆分析器来确定质荷比。可以通过使用几种检测模式来检测离子。例如，可以检测选择的离子(即，使用选择性离子监控模式(SIM))，或者作为选择，可以使用扫描模式进行离子检测。优选地，离子通过使用SIM检测。实施例1-分析稈序尿液、血浆和脑脊髓液(CSF)样品从正常的个体中获得。肝素化血浆样品从禁食过夜后的患者收集。小儿患者的非-禁食样品被使用。如下程序用于尿液、血浆和CSF中氨基酸定量。氖化的内标被添加到大约100ii1测试材料(即，血浆、尿液或CSF)中以形成测试混合物。然后测试混合物通过10000分子量的滤器以提供低分子量滤液部分作为测试样品，然后在氮气中在40-75t:下干燥。干燥的样品溶于大约25iU的再干溶液(等体积的甲醇、1M乙酸钠和三乙胺)中，并且在氮气中在4(TC下干燥。样品溶于50iU的衍生化溶液(1.12iil的100%甲醇、1.60ii1水、1.60iil的100%三乙胺和1.60iil的100苯基异硫氰酸酯(PITC))。然后溶解的样品在大约4(TC加热大约15-20分钟，然后在液氮下在50-60°C干燥。干燥的样品溶于100iU的重构溶液(95%1120、5%乙腈)中，涡旋，并转移到小瓶中，用于LC/MS。使用具有ThermoB-BasicC-18(250X2.lmm)HPLC柱的Agilent1100SeriesLC/MSD，进行样品氨基酸的LC/MS测定。流动相由(A)20mM乙酸铵和(B)100%乙腈组成，加热到5(TC。使用如下分段梯度从柱子中洗脱样品氨基酸<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>当分离的氨基酸离开HPLC柱时，它们被引入喷雾室，在其中流出液被喷雾并通过电喷雾离子源去溶剂化。PITC衍生物在电喷雾过程中带上负电荷，然后通过四极滤质器(quadrupolemassfilter)进行进一步分离。检测了氨基酸离子并测量了它们的丰度。每个氨基酸离子与其内标的面积丰度之比对六点标准曲线作图。图l和2显示了典型运行的结果。实施例2-血浆中氨基酸含暈的暈化对获自婴儿(《30天)、幼儿(l-23.9个月)、儿童(2-17.9岁)和成人18岁)的肝素化血浆样品进行氨基酸分析。所有个体被评估为临床上正常或从提交用于传染病测定的样品中获得。所有的对象都是完全可以走动的、社区居住的、健康的和未进行药物治疗的。测试组的人口统计学如下<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>基于这些血浆样品的分析，使用标准参数和非参数的统计学方法，建立了正常的参考范围。如果数据被确定为是高斯的，则选择适当的平均数士2SD范围。如果数据是非_高斯的，则选择非参数的95百分位数范围或观察到的范围。表1提供了测定的每个氨基酸的正常参考范围，以及量限(L0Q)。参考范围以yM(微摩尔每升)提供。无法检测的氨基酸的正常范围应该被理解为低于或等于L0Q。表l:成人和小儿血浆中的氨基酸水平氨<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例3-尿液中M某酸含量的量化对获自婴儿(《30天)、幼儿(l-23.9个月)、儿童(2_17岁)和成人(>17岁)的尿液样品进行氨基酸分析。所有个体被评估为临床上正常或从提交用于传染病测定的样品中获得。所有的对象都是完全可以走动的、社区居住的、健康的和未药物治疗的。测试组的人口统计学如下<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>尿液的氨基酸含量最初在浓度(ymol氨基酸每升尿液；PM)基础上测量。然后基于尿的肌酸酐水平标准化氨基酸浓度，并且使用标准参数和非参数的统计学方法，建立正常的参考范围。如果数据被确定为是高斯的，则选择适当的平均数士2SD范围。如果数据是非_高斯的，则选择非参数的95百分位数范围或观察到的范围。表2提供了所测定的每个氨基酸的正常参考范围(毫摩尔/摩尔肌酸酐)。量限(L0Q)是基于尿液中的氨基酸测定，未对肌酸酐进行调整。无法检测的氨基酸的正常范围应该被理解为低于或等于L0Q。表2.*成人和小儿尿液中的氨基酸水平(mmol/mo肌酸酐)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例4-脑脊髓液(CSF)中氨基酸含暈的量化对由婴儿(《3个月)、幼儿(3-23.9个月)、儿童(2-10岁)和成人(〉10岁)获得的CSF样品进行氨基酸分析。所有个体被评估为临床上正常或从提交用于传染病确诊的样品中获得。所有的对象都是完全可以走动的、社区居住的、健康的和未药物治疗的。测试组的人口统计学如下<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>基于这些CSF样品的分析，使用标准参数和非参数的统计学方法，建立正常的参考范围。如果数据被确定为是高斯的，则选择适当的平均数士2SD范围。如果数据是非-高斯的，则选择非参数的95百分位数范围或观察到的范围。表3提供了所测定的每个氨基酸的正常参考范围，以及量限(L0Q)。参考范围被提供为yM(微摩尔每升)。无法检测的氨基酸的正常范围应该被理解为低于或等于L0Q。表3:成人和小儿CSF中的氨基酸水平<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例5-唾液中氨某酸含量的量化对九(9)个成人(3名男性和6名女性)的唾液样品进行了氨基酸分析。所有个体被评估为临床上正常并且是完全可以走动的、社区居住的、健康的和未药物治疗的。表4提供了实际测量的氨基酸水平的范围。为了诊断的目的，这些范围被认为是"正常"范围。无法检测的氨基酸的正常范围应该被理解为低于或等于L0Q。表4:成人唾液中的氨基酸水平<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>所有在说明书中引用的专利和其它参考文献是本发明所属领域的技术人员的技术水平的指示，并且以其整体-包括任何表格和图形-通过参考并入，其引入的程度如同每篇参考文献分别以其整体通过参考并入。本领域的技术人员将容易理解本发明很适于获得提及的结果和优点，以及本文固有的那些结果和优点。作为目前的优选的实施方式的代表，本文描述的方法、变化和组合是示例性的并且不意图为本发明范围的限制。本领域的技术人员将想到的其变化和其他用处——其包含在本发明的精神中——通过本权利要求的范围限定。可以对本文公开的本发明进行各种替代和修正而不脱离本发明的范围和精神，这对本领域的技术人员来说是很明显的。因此，这种额外的实施方式在本发明和所附权利要求的范围之内。于此说明性地描述的本发明适宜地可以在不存在任何元素或多个元素，在此没有特别公开的限制或多个限制的情况下实践。因此，例如，在本文的每种情况下，任何一个术语"包含"、"基本上由……组成"和"由……组成"可以与其他两个术语的任一个相互替换。已被使用的术语和表述被用作说明的术语而不是限制，并且不意图使用排除所显示和描述的特征的任何等价物或其部分的这种术语和表述，但是认识到各种改进在本发明要求的范围内是可能的。因此，应该理解，尽管已经通过优选的实施方式和任选的特征具体地公开了本发明，但是本文公开的概念的改进和变化可以被本领域的技术人员采取，并且这种改进和变化被认为在本发明范围之内，如所附的权利要求所定义的。此外，在以马库什(Markush)组或其它替代性分组描述了本发明特征或方面的情况下，本领域的技术人员将认识到，本发明也因此以马库什(Markush)组或其它组的任何个体成员或成员的子组进行描述。同样，除非相反地指明，在为实施方式提供各种数值处，通过取任何两个不同值作为范围的端点描述额外的实施方式。这样的范围也在描述的发明范围之内。因此，额外的实施方式在本发明和所附权利要求的范围之内。2权利要求一种鉴定个体体液内一种或多种个体氨基酸的存在的方法，包括(a)衍生化所述体液内的氨基酸；(b)通过液相层析法(LC)分离该衍生化氨基酸；和(c)用质谱法(MS)分析，鉴定来自步骤(b)的所述衍生化氨基酸，并通过与来自一系列氨基酸标准物的结构上相似的氨基酸进行比较来量化所述衍生化氨基酸，并且其中所述MS不是串联MS。2.—种确定个体体液是否包含异常水平的一种或多种氨基酸的方法，包含(a)衍生化所述体液内的氨基酸；(b)通过液相层析法(LC)分离该衍生化氨基酸；禾口(c)用质谱法(MS)分析，鉴定来自步骤(b)的所述衍生化氨基酸，并通过与来自一系列氨基酸标准物的结构上相似的氨基酸进行比较来量化所述衍生化氨基酸，并且其中所述MS不是串联MS。3.根据权利要求1-2的任一项所述的方法，其中鉴定的衍生化氨基酸的至少一种选自磷酸丝氨酸、磺酸_半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3_甲基-组氨酸、a-氨基-己二酸、e-丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基_丁酸、P_氨基_异丁酸、半胱氨酸丄_别-胱硫醚_A、L-胱硫醚、胱氨酸、别_异亮氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。4.根据权利要求1-3的任一项所述的方法，其中鉴定的衍生化氨基酸的至少一种选自磷酸丝氨酸、磺酸_半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、天冬氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3_甲基-组氨酸、a-氨基-己二酸、e-丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基_丁酸、P_氨基_异丁酸、半胱氨酸、L-别-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。5.根据权利要求1-4的任一项所述的方法，其中鉴定的衍生化氨基酸的至少一种选自磷酸丝氨酸、磺酸-半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3_甲基-组氨酸、a-氨基-己二酸、e-丙氨酸、脯氨酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、P_氨基_异丁酸、半胱氨酸、L-别-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、别_异亮氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。6.根据权利要求1-5的任一项所述的方法，其中鉴定的衍生化氨基酸的至少一种选自磷酸丝氨酸、磺酸_半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3_甲基-组氨酸、a-氨基-己二酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、e-氨基-异丁酸、L-别_胱硫醚_A、L-胱硫醚、胱氨酸、别_异亮氨酸卬L-羟赖氨酸卬L-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。7.根据权利要求1-6的任一项所述的方法，其中鉴定的衍生化氨基酸的至少一种选自磷酸丝氨酸、磺酸_半胱氨酸、精氨琥珀酸、羟脯氨酸、磷酸乙醇胺、肌氨酸、肌肽、鹅肌肽、1，3_甲基-组氨酸、a-氨基-己二酸、乙醇胺、Y-氨基-丁酸、e-氨基-异丁酸、L-别-胱硫醚-A、L-胱硫醚、胱氨酸、DL-羟赖氨酸、DL-别-羟赖氨酸和高胱氨酸。8.根据权利要求1-7的任一项所述的方法，其中鉴定的衍生化氨基酸的至少一种选自酪氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸和组氨酸。9.根据权利要求1-8的任一项所述的方法，其中鉴定的衍生化氨基酸的至少一种选自胱氨酸和谷氨酰胺。10.根据权利要求1-9的任一项所述的方法，其中鉴定的衍生化氨基酸的至少一种选自色氨酸和组氨酸。11.根据权利要求i-io的任一项所述的方法，其中鉴定的衍生化氨基酸的至少一种是丙氨酸。12.根据权利要求l-ll的任一项所述的方法，其中鉴定的衍生化氨基酸的至少一种选自酪氨酸和苯丙氨酸。13.根据权利要求1-12的任一项所述的方法，其中所述体液选自血浆、尿液、脑脊髓液(CSF)和唾液。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述体液是唾液。15.根据权利要求1-12的任一项所述的方法，其中所述体液是血浆并且将至少一种鉴定的衍生化氨基酸的数量与表1提供的参考范围相比较。16.根据权利要求1-12的任一项所述的方法，其中所述体液是尿液并且将至少一种鉴定的衍生化氨基酸的数量与表2提供的参考范围相比较。17.根据权利要求1-12的任一项所述的方法，其中所述体液是CSF并且将至少一种鉴定的衍生化氨基酸的数量与表3提供的参考范围相比较。18.根据权利要求1-12的任一项所述的方法，其中所述体液是唾液并且将至少一种鉴定的衍生化氨基酸的数量与表4提供的参考范围相比较。19.根据权利要求1-18的任一项所述的方法，其中所述至少一种氨基酸用苯基异硫氰酸酯(PITC)、邻苯二醛(0PA)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)或Na(2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(FDAA)衍生化。20.根据权利要求1-18的任一项所述的方法，其中所述至少一种氨基酸用PITC衍生化。21.根据权利要求1-20的任一项所述的方法，其中所述方法对至少五个氨基酸的量进行定量。22.根据权利要求1-21的任一项所述的方法，其中所述方法对至少十五个氨基酸的量进行定量。全文摘要本发明公开提供了对从人类患者获得的各种体液中的个体氨基酸进行定量的方法。也提供了各种体液内(例如血浆、尿、脑脊髓液和唾液)和各年龄组(例如，婴儿、幼儿、儿童和成人)正常氨基酸水平的参考范围。文档编号G01N33/00GK101796408SQ200880024878公开日2010年8月4日申请日期2008年6月27日优先权日2007年6月29日发明者S·戈尔德曼申请人:奎斯特诊断投资公司