反相高效液相色谱检测阿哌沙班中起始物料Ⅱ的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种反相高效液相色谱检测阿哌沙班中起始物料II的方法。
【背景技术】
[0002] 阿哌沙班的化学名称为：1- (4-甲氧基苯基）-7-氧代-6- [4- (2-氧代-哌 啶-1-基）苯基]-4, 5, 6, 7-四氢-IH-吡唑[3, 4-C]-吡啶-3-甲酰胺，分子式=C25H25N5O4, 分子量：459. 50,结构式如下所不：
[0003]
[0004] 阿哌沙班目前未在中国境内上市销售，现已上市销售的阿哌沙班产品有阿哌 沙班片。阿哌沙班片收载于国家食品药品监督管理总局《进口药品注册标准》，标准号： JX20120076。
[0005] 在阿哌沙班合成过程中，采用了两个起始物料定向合成，即起始物料I和 起始物料II，起始物料I化学名称为：1 _ [4- (2-氧代哌啶-1-基）-苯基]-3-(吗 啉-4-基）-5, 6-二氢-2H-吡啶-2-酮；分子式=C2qH25N3O3;分子量：355. 43 ;起始物料II化 学名称为：2_氯-2-[2-(4-甲氧基苯基）亚肼基]乙酸乙酯；分子式=C11H 13ClN2O3;分子量 256. 69。作为关键的起始物料II的结构式如下所示：
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[0007] 目前市场供应起始物料II的化工厂商较多，各个厂商提供的起始物料II质量差异 较大且会存在一些杂质化合物，这些杂质化合物的存在会严重影响其合成产品的质量和用 药安全，因此需要对起始物料II进行检测和监控。
[0008] 反相高效液相色谱是一种常用的检测方法，采用非极性或相对极性较弱的固定 相，以极性较强的溶剂作为流动相，常用于分离、检测非极性和极性较弱的化合物；反相 高效液相色谱在现代液相色谱中的应用最为广泛，据统计，它占整个高效液相色谱应用的 80%左右。
[0009] 阿哌沙班及其起始物料II均为极性较弱的化合物，通常采用反相高效液相色谱检 测其中的杂质，如：阿哌沙班片质量标准中就是采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反 相高效液相色谱进行检测阿哌沙班片中的有关物质，该方法采用梯度洗脱，流动相配制复 杂，系统平衡时间较长，操作繁琐，用于起始物料II的检测，出峰太快，不太适合起始物料II 的质量控制。
[0010] 因此，需要开发一种检测阿哌沙班起始物料II的新方法。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供反相高效液相色谱检测阿哌沙班中起始物料II的方法。
[0012] 本发明提供的反相高效液相色谱检测阿哌沙班中起始物料II的方法，它包括以下 步骤：
[0013] a、制备供试品溶液：称取起始物料II用流动相溶解并稀释，得到浓度为0.8~ I. 2mg/ml的供试品溶液；
[0014] b、采用反相高效液相色谱对供试品溶液进行检测：
[0015] 色谱柱的固定相：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
[0016] 流动相为乙腈、0· 015mol/L-0. 025mol/L磷酸二氢钾溶液，体积比为40% :60%~ 50% :50% 混合；
[0017] 检测波长为220nm~230nm ;
[0018] c、按面积归一化法计算供试品中单个杂质和总杂质的含量。
[0019] 进一步的，步骤b中，色谱柱的规格：内径为4. 6mm，长度为150mm-250mm，填料粒径 为3. 5um-5 μ m。优选的，步骤b中，色谱柱的规格：内径为4. 6mm，长度为150mm，填料粒径 为 5 μ m〇
[0020] 进一步的，步骤b中，色谱柱为Waters Symmetry C18。
[0021] 进一步的，步骤b中，所述0· 015mol/L-0. 025mol/L磷酸二氢钾溶液为0· 02mol/L 磷酸二氢钾溶液、〇. 〇15mol/L磷酸二氢钾溶液或0. 025mol/L磷酸二氢钾溶液。
[0022] 进一步的，步骤b中，乙腈与0. 02mol/L磷酸二氢钾溶液的体积比为40% :60%~ 50% :50% ;乙腈与0. 015mol/L磷酸二氢钾溶液的体积比为40% :60%~50% :50% ;乙腈 与0. 025mol/L磷酸二氢钾溶液的体积比为40% :60%~50% :50%。
[0023] 进一步的，步骤b中，乙腈与0. 02mol/L磷酸二氢钾溶液的体积比为45% :55%。
[0024] 进一步的，步骤b中，柱温为30°C~40°C ;流速为0· 8ml/min~I. 2ml/min。
[0025] 进一步的，步骤b中，柱温为30°C或35°C或40°C;流速为0. 8ml/min或1.0 ml/min 或 L 2ml/min〇
[0026] 进一步的，步骤b中，检测波长为225nm。
[0027] 进一步的，步骤b中，进样量为20 μ 1。
[0028] 本发明反相高效液相色谱检测阿哌沙班中起始物料II有关物质的方法，起始物料 II与各杂质成分之间分离良好，流动相组成简单，同时，本发明方法的检测结果准确、可靠， 通过控制阿哌沙班合成过程中起始物料的质量，达到了进一步加强成品合成过程控制的目 的。
[0029] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0030] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0031] 图1实施例1本发明方法对样品初步的检测结果；
[0032] 图2实施例1对比试验方法对供试品溶液的检测结果；
[0033] 图3试验例3的标准曲线图；
[0034] 图4试验例4专属性试验的检测结果；其中，图4-(a)为高温破坏、图4-(b)为光 破坏、图4-(c)为碱破坏、图4-(d)为酸破坏、图4-(e)为氧化破坏。
【具体实施方式】
[0035] 本发明【具体实施方式】中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0036] 高效液相色谱仪（型号：LC_20AT二元栗，生产厂家：日本岛津公司）
[0037] 电子天平（型号：AUW220D，生产厂家：日本岛津公司）
[0038] 实施例1
[0039] 1、确定检测波长
[0040] 精密称取起始物料II适量，用流动相（乙腈-0. 02mol/L磷酸二氢钾=45 :55)配 制成浓度为20 μ g/ml的溶液，作为供试品溶液。
[0041] 取上述供试品溶液，在200nm~400nm波长范围内进行扫描，试验结果见表1。
[0042] 表1本发明的紫外扫描结果
[0043]
[0044] 试验结果表明，检测波长在220nm~230nm
范围内，均适合本发明的高效液相色谱 检测方法；优选的，检测波长为225±2nm。
[0045] 2、高效液相色谱检测方法
[0046] 采用反相高效液相色谱进行检测：
[0047] 色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Waters Symmetry C18,规格为：内径为4. 6mm， 长度为150mm，填充剂粒径为5 μ m ;
[0048] 流动相：乙腈-0· 02mol/L磷酸二氢钾（体积比为45 :55);
[0049] 柱温：35 cC ;
[0050] 流速：1.0 ml/min ;
[0051] 检测波长：225nm;
[0052] 进样量：20 μ 1。
[0053] 制备供试品溶液：称取起始物料II约25mg，置于25ml量瓶中，加流动相（乙 腈-0. 02mol/L磷酸二氢钾=45 :55)，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0054] 供试品溶液的检测结果见图1，起始物料II保留时间为23. 211min，理论塔板数 (按II计算）为192423,分离度为55. 041，峰纯度指数为：0.999971。上述反相高效液相色 谱检测供试品溶液，结果为：单个杂质为0. 519%，总杂质为1. 570%。本发明反相高效液相 色谱可以用于检测阿哌沙班起始物料II的有关物质。
[0055] 对比试验：采用反相高效液相色谱进行检测
[0056] 按照《进口药品注册标准》阿哌沙班片有关物质检测方法：
[0057] 色谱柱的填充剂：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Waters xbridge shield Rpl8,150X4. 6mm，3. 5 μπι或其他性能相当色谱柱）；
[0058] 流动相：以30mmol/L醋酸铵溶液-乙腈（90 :10)为流动相A，30mmol/L醋酸铵溶 液-乙腈（5 :95)为流动相B，按下表进行梯度洗脱：
[0060] 流速：I. 5ml/min ;
[0061] 检测波长：225nm;
[0062] 制备供试品溶液：称取起始物料II约25mg，置于25ml量瓶中，加溶剂（乙腈-水 =50 :50)，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
[0063] 供试品溶液的检测结果见图2,起始物料II主峰的保留时间为I. 261min，保留时 间太靠前，不能满足本品有关物质检测的需要。
[0064] 为了进一步说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例：
[0065] 试验例1流动相筛选试验
[0066] 选择不同的流动相进行筛选试验，其他色谱条件如下：
[0067] 色谱柱的填充剂：色谱柱的型号为Waters Symmetry C18,规格为：内径为4. 6mm， 长度为150mm，填充剂粒径为5 μ m ;
[0068] 柱温：35 Γ ;
[0069] 流速：1.0 ml/min ;
[0070] 检测波长：225nm ;
[0071] 进样量：20μ1;
[0072] 按照实施例1的方法进行系统适用性试验，检测结果见表2 :
[0073] 表2流动相筛选试验结果
[0075] 表2中，流动相"例如：乙腈-0· 02mol/L磷酸二氢钾（45 :55) "具有中国药典2010 年版通常具有的含义，其中45 :55表示乙腈与0. 02mol/L磷酸二氢钾的体积比；保留时间 是指起始物料II的保留时间；分离度是指起始物料II与相邻杂质之间的分离度；拖尾因子 是指起始物料II的拖尾因子；理论塔板数是指理论塔板