专利名称：一种利用反相高效液相色谱分析游离氨基酸的方法
技术领域：
本发明属于仪器分析技术领域，具体地涉及一种利用反相高效液相色谱仪对样品 中游离氨基酸进行分析的方法。
背景技术：
迄今为止，自然界中已发现180多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有 20多种，称为基本氨基酸。由于氨基酸分析在蛋白质化学、生物化学、食品科学、临床医学等 领域的研究中起着重要的作用，因此，对氨基酸分析方法的研究与改进得到人们高度重视。 1958年，Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋 白质中的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化，该方法就是氨基酸分析仪，但传统的氨基酸 分析仪结构复杂，价格昂贵，而且一般都不能作其他分析使用。氨基酸含量检测主要应用氨基酸自动分析仪和高效液相色谱(HPLC)。随着HPLC 的发展，使用HPLC技术分析氨基酸获得迅速发展，由于HPLC技术无需特殊反应装置，具有 高效、简便、快速、准确和价格低廉等优点，已在许多实验室部分或全部代替了氨基酸自动 分析仪，广泛应用于多种生物样品内氨基酸的检测。HPLC测定氨基酸的方法也很多，反相高 效液相色谱(RP-HPLC)检测氨基酸的柱前衍生试剂就有近10种。吕艳等在《浙江农业科学》2006年第2期的“反相高效液相色谱定量分析多肽中 的氨基酸组成”中公开了蛋白质中氨基酸的检测方法，部安珍在《安徽大学学报(自然科学 版)》1991年第3期的“0PA柱前衍生法用于反相高效液相色谱分析氨基酸”公开了细胞色 素C酶解产物中氨基酸的检测，上述文献中公开的方法在定量和定性检测氨基酸的时候都 具有缺陷，吕艳等的方法不能分析全部的氨基酸，对氨基酸分析的种类具有局限性，而邬安 珍的方法同样是不能对所有的氨基酸进行分析，其方法也存在局限性。本发明为克服现有方法的缺陷，提供了一种新的氨基酸分析方法。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种利用反相高效液相色谱仪对样品中游离 氨基酸进行定性、定量分析的方法，该方法包括如下步骤首先对样品进行预处理，然后对样品中的半胱氨酸的-SH进行保护，然后利用衍 生试剂0PA(邻苯二甲醛)和FM0C(氯甲酸芴甲酯)分别对一级、二级氨基酸进行柱前衍生 化处理，然后进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析。其中一级氨基酸是指天门冬氨酸，谷氨酸，天门冬酰胺，丝氨酸，谷氨酰胺，组氨 酸，甘氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，瓜氨酸，精氨酸，丙氨酸，酪氨酸，胱氨酸，缬氨酸，蛋氨酸，正 缬氨酸，色氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸，亮氨酸或赖氨酸。二级氨基酸是指羟脯氨酸，肌氨酸 或脯氨酸。上述方法中，对样品进行预处理的步骤为对样品溶液进行离心，取上清液加入三氯乙酸，放于低温静置，再离心，取上清液过0. 2-0. 45um微孔滤膜，得样品处理液；上述方法中，对半胱氨酸的-SH进行保护的步骤为将上述处理液与DTDPA反应，得保护液。更具体地的步骤是将上述处理液1份加 入1-5份的DTDPA溶液，混勻，置60-100°C水浴中加热反应0. 5-2小时，得保护液。上述方法中，柱前衍生化处理步骤为用1-5倍保护液的OPA、FM0C对保护液进行衍生，得柱前衍生处理液。上述方法中，反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析指是指通过流动相梯度洗脱，进 行双波长检测柱前衍生处理液，洗脱和检测的条件为色谱柱C18或C8反相色谱柱流动相A 体积比为92-98 8_2的0. lmol/L醋酸钠-乙氰溶液流动相B 体积比为3-6 2-1的乙氰-水溶液洗脱液流速0.5-2ml/min流动相的洗脱如表1 表1 流动相梯度洗脱表检测波长338nm ( 一级氨基酸)，262nm ( 二级氨基酸)。具体地，上述反相高效液相色谱分析的条件是检测是利用二极管阵列检测器，0PA是指邻苯二甲醛，其浓度为2. 5mg/ml,FM0C是 指氯甲酸芴甲酯，其浓度为10mg/ml，DTDPA是指3，3' _2_硫代-2-丙酸，其浓度为0. lg/ ml, pH 为 10. 0。一级氨基酸是指如下表3中的1-22号氨基酸，二级氨基酸是指23-25号氨基酸。优选地，本发明提供了一种利用反相高效液相色谱仪对样品中游离氨基酸进行定 性、定量分析的方法，该方法包括如下步骤(1)取样品溶液适量，以4000r/min离心10-30min，取上清液，加入适量三氯乙酸， 放于0-10°C静置0. 5-2h，再以离心处理，取上清液适量，过0. 2um-0. 45um微孔滤膜，得样品
处理液。(2)取上述步骤⑴得到的样品处理液1份，加入DTDPA溶液1-3份，混勻，置 60-100°C水浴加热0. 5-2小时，得保护液。(3)吸取步骤⑵得到的保护液1份，吸取1-3份0PA，混合，再吸取1-3份FM0C， 混合，再吸取50-100份水，混合，得柱前衍生处理液。(4)梯度洗脱和检测洗脱液流动相A 醋酸钠乙氰=92-98 8_2，调pH值至6_10 ；流动相B 乙 氰水=3-6 2-1 ；洗脱液流速() 5-2ml/min
色谱柱C18或C8反相色谱柱洗脱时间和浓度如下表2: 表2 流动相梯度洗脱表检测采取双波长检测，检测波长为检测一级氨基酸的波长为338nm，检测二级氨基酸的波长为262nm，定性、定量分析绘制标准曲线，定性定量分析样品液中的游离氨基酸。上述方法中，0PA浓度为 2. 5mg/ml，FM0C 浓度为 10mg/ml，DTDPA 浓度为 0. lg/ml， pH 为 10. 0。有益效果本发明的方法使用的系统配置是标准的液相配置，除氨基酸分析外，还可用于其 他分析工作，且具有检测灵敏度高、样品处理简单、分析时间短、分析结果稳定、重复性好等 特点。本方法可对样品液中25种游离氨基酸同步检出，特别是对半胱氨酸先采用DTDPA 进行-SH保护后再与其他氨基酸一起进行同步衍生，检测的种类多，效率高。附图简述
图1 :25种氨基酸标准品分离色谱1是采用实施例1的方法对25种氨基酸标准品分离色谱图，图1中的1-25个 数字代表每种氨基酸的峰号，具体的峰号对应的氨基酸及其缩写如下表3 表3 峰号、氨基酸和缩写对照表
具体实施例方式取样品溶液50ml，以4000r/min离心lOmin，取上清液25ml，加入25ml三氯乙酸 (质量分数2% )，放于4°C静置2h，再以4000r/min离心lOmin，取上清液2ml，过0. 2um微 孔滤膜；取上述处理液0. 5ml，加入浓度为0. lg/ml, pH为10. 0的DTDPA溶液0. 5ml，混勻， 置80°C水浴加热1小时；配置流动相A 0. lmol/L醋酸钠乙氰=93 7，调PH值至6. 5 ； 流动相B:乙氰水=4 1 ；设置自动进样器进行柱前衍生吸取样品0.5ul，吸取0.5ul 的浓度为2. 5mg/ml的0PA，混合，吸取0. 5ul的浓度为10mg/ml的FM0C加入混合，再吸取水 32ul加入混合，进样；按照如下表4进行梯度洗脱 条件为色谱柱C18反相色谱柱洗脱液流速2ml/min检测波长338nm、262nm利用本方法分析的氨基酸种类参见说明书附图1和附图1的简述。本发明的方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发 明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离 本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为 包括在本发明的范围之内。
权利要求
一种利用反相高效液相色谱仪对样品中游离氨基酸进行定性、定量分析的方法，该方法包括如下步骤首先对样品进行预处理，然后对样品中的半胱氨酸的 SH进行保护，然后利用衍生试剂OPA(邻苯二甲醛)和FMOC(氯甲酸芴甲酯)分别对一级、二级氨基酸进行柱前衍生化处理，然后进行反相高效液相色谱(RP HPLC)分析。
2.根据权利要求1所述的方法，其中对样品进行预处理的步骤为对样品溶液进行离心，取上清液加入三氯乙酸，放于低温静置，再离心，取上清液过 0. 2-0. 45um微孔滤膜，得样品处理液；
3.根据权利要求1所述的方法，其中对半胱氨酸的-SH进行保护的步骤为将上述处理液与DTDPA反应，得保护液。
4.根据根据权利要求1或3所述的方法，其中对半胱氨酸的-SH进行保护的步骤为 将处理液1份加入1-5份的DTDPA溶液，混勻，置60-100°C水浴中加热反应0. 5-2小时，得 保护液。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中DTDPA是指3，3'_2_硫代-2-丙酸，其浓度 为 0. lg/ml，pH 为 10. 0。
6.根据权利要求1所述的方法，其中柱前衍生化处理步骤为用1-5倍保护液的OPA、FM0C对保护液进行衍生，得柱前衍生处理液。
7.根据权利要求1或6所述的方法，其中0PA是指邻苯二甲醛，其浓度为2.5mg/ml， FM0C是指氯甲酸芴甲酯，其浓度为10mg/ml。
8.根据权利要求1所述的方法，其中反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析指是指通过流 动相梯度洗脱，进行双波长检测柱前衍生处理液，洗脱和检测的条件为色谱柱C18或C8反相色谱柱，流动相A 体积比为92-98 8-2的0. lmol/L醋酸钠-乙氰溶液，流动相B 体积比为3-6 2-1的乙氰-水溶液，洗脱液流速0. 5-2ml/min,检测波长一级氨基酸检测波长为338nm，二级氨基酸检测波长为262nm。
9.根据权利要求8所述的方法，其中检测是利用二极管阵列检测器。
全文摘要
本发明涉及一种利用反相高效液相色谱仪对样品中游离氨基酸进行定性、定量分析的方法，该方法包括步骤首先对样品进行预处理，然后对样品中的半胱氨酸的-SH进行保护，然后利用衍生试剂OPA(邻苯二甲醛)和FMOC(氯甲酸芴甲酯)分别对一级、二级氨基酸进行柱前衍生化处理，然后进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析。本方法可对样品液中25种游离氨基酸同步检出，特别是对半胱氨酸先采用DTDPA 进行-SH保护后再与其他氨基酸一起进行同步衍生，检测的种类多，效率高。
文档编号G01N30/02GK101893611SQ201010221090
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月8日 优先权日2010年7月8日
发明者邓莉, 邢海鹏, 郝学财 申请人:天津春发食品配料有限公司