专利名称：肌酐诊断试剂(盒)及肌酐的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种肌酐诊断试剂(盒)，同时本发明还涉及测定肌酐浓度的方法，属
于医学检验测定技术领域。
背景技术：
测定肌酐主要有化学测定法(Jaffe法)、酶法、高效液相层析法和毛细管电泳法 等。 化学测定法成本低廉，操作简便，是目前国内测定肌酐最常用的方法之一。标本中 的肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌酐复合物。此法的缺点是特异性不高，维生 素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多巴以及高浓度葡萄糖、蛋白质和一些抗生素如青霉素G、头孢 西丁、头孢唑啉等也能与碱性苦味酸反应生成红色。 高效液相层析法(HPLC)，肌酐在弱酸性环境中带正电荷，通过阳离子交换层析柱 可与其他成分很好分离，在234nm测定其光吸收。此法分析的精密度高、特异性好，但本法 不适于大批量临床标本分析，通常作为肌酐测定的参考方法，用于评价市售肌酐测定的试 剂盒和某些科研目的。检索发现，申请号为90106198. 0、申请日为1990. 12. 18的中国专利 申请公开了用高效液相色谱直接测定人尿中假尿嘧啶核苷(简称假尿苷)，再通过分光光 度法同时测出肌酐，分别用假尿苷和假尿苷/肌酐作为鼻咽癌和肺癌的标志物。(这个专利 和我们的无关) 毛细管电泳法，血清标本用高速离心作预处理，尿液标本可用低速离心，除去有形 成分，上清液用胶束动电毛细管电泳分离后测定235nm处吸光度。本法测定线性范围宽，操
作较为简便，但需用特殊设备和进行血清标本的预处理，临床常规使用困难。 酶学测定法主要有肌酐脱亚胺酶(Creatinine deiminase)和肌酐酶
(Creatininase)两大类。 检索发现，申请号为02139298. 6、申请日为2002. 11. 15的专利申请公开了应用 酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测 定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类 似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶_底物-NAD 或酶_底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟 酰胺辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发 明所指的酶法试剂就可达到测定样本中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、 氨、肌酐和二氧化碳等的目的。该发明的特点在于为丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨 基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等的测试提供一个内源合成 丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二 氧化碳试剂等反应所需要的底物-还原型烟酰胺辅酶。其缺点之一为，这个系统在生成反 应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基 转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶， 这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。 据申请号为02139298. 6、申请日为2002. 11. 15的专利介绍，该系统由于不断生成 测定所需的NADH或NADPH，从而大大提高了试剂的稳定性，并大大降低试剂的生产成本。其 实在试剂中加入NADH或NADra的稳定剂已经不是困难或增加成本的问题，反而比在试剂中 增加一个反应系统要经济得多。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出 一 种利用间接酶循环扩增法 (IndirectEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method) 及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅 酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定肌酐浓度的方法，同时，本发明还将给出用以 实现该方法的肌酐诊断试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自 动生化分析仪上进行肌酐浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广 应用。 本发明肌酐浓度测定方法如下 肌酐+水肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨 氨+含氧酸+过氧化氡氨某酸氧化酶氨某酸+水+氧 氨基酸+水+辅酶氨基酸脱氢酶含氧酸+氨+还原型辅酶 这种方法应用肌酐脱亚胺酶(creatinine deaminase ;EC 3. 5. 4. 21)酶(偶)联 氨基酸氧化酶(amino acid oxidase ;EC 1. 4. 3. 2 ;EC 1. 4. 3. 3)、氨基酸脱氢酶(aminoacid dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 5 ;EC 1. 4. 99. 1)酶促反应连续监测法。肌酐脱亚胺酶及氨基酸 氧化酶作为作用酶，功能为将肌酐酶解产生氨，再生成丙氨酸。氨基酸脱氢酶作为循环酶 氨基酸脱氢酶的酶促作用使丙氨酸再次变回氨，使氨不断地被重复循环利用。氨基酸脱氢 酶又作为显色酶，将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有 吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光 度上升的速度，可以测算出肌酐的浓度。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单 剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明肌酐诊断试剂(盒)较为理想缓冲液100,1/L稳定剂500,1/L辅酶3mmol/L肌酐脱亚胺酶10000U/L氨基酸氧化酶12000U/L氨基酸脱氢酶12000U/L含氧酸15mmol/L过氧化氢10mmol/L 本发明的肌酐诊断试剂(盒)可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、辅酶、肌酐脱亚胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶、含氧酸、过氧化氢。 试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂1 缓冲液、稳定剂、辅酶、含氧酸、过氧化氢。
试剂2 缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶。 辅酶、肌酐脱亚胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶、含氧酸、过氧化氢在试剂1或 试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂
试剂1 缓冲液、稳定剂、辅酶、含氧酸、过氧化氢。
试剂2 缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶。
试剂3 缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶。 辅酶、肌酐脱亚胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶、含氧酸、过氧化氢在试剂1、试 剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。 无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定肌酐浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一 本实施例的肌酐诊断试剂为单试剂，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 500mmol/L 辅酶 3mmol/L 肌酐脱亚胺酶 10000U/L 氨基酸氧化酶 12000U/L 氨基酸脱氢酶 12000U/L 含氧酸 15mmol/L 过氧化氢 10mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净 水，复溶后使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，起始吸光度《0. l，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测肌酐样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为
正反应(上升反应)，延迟时间大约3分钟左右，检测时间2分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测
主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出肌酐的浓度大小。 实施例二
本实施例的肌酐诊断试剂为双试剂，包括 试剂l
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 稳定剂 辅酶
过氧化氢 试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷 稳定剂
肌酐脱亚胺酶
100,1/L 50mmol/L 3mmol/L 15mmol/L 1Ommol/L
盐酸缓冲液
100,1/L 50mmol/L 10000U/L 12000U/L 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间10分钟，起始吸光度《0. l，测 试主波长340nm，测试副波长405nm，被测肌酐样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5， 反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约3分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出肌酐的浓度大小。实施例三本实施例的肌酐诊断试剂为三试剂，包括试剂l三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100,1,稳定剂50mmol/L辅酶3mmol/L含氧酸15mmol/L过氧化氢10mmol/L试剂2三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100,1,稳定剂500,1/L氨基酸氧化酶12000U/L氨基酸脱氢酶12000U/L试剂3三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液100,1,1
稳定剂 500mmol/L 肌酐脱亚胺酶 10000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。测定肌酐浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37t:，反应时间IO分钟，起始
吸光度《0. 1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测肌酐样品与试剂1、试剂2、试剂3
的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约3分钟左右，检测
时间2分钟左右。 加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测 主波长340nm吸光度上升的速度，从而测算出肌酐的浓度大小。 申请人:经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到本发明 的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。 总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所 需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0. 0008 ;吸光度时间反应曲线应呈上 升曲线直至终点；试剂可测有效(R > 0. 99)线形范围可达2mmol/L ;试剂测试的不准确度， 其相对偏差不超过±4%;试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵 敏度可达O. 4±0. 2 AA/mmol/L ;试剂在2-8。C下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏 度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
一种酶循环扩增法、酶比色法及酶联法的肌酐的浓度测定方法，其方法如下肌酐+水 肌酐脱亚胺酶 N-甲基海因+氨氨+含氧酸+过氧化氢 氨基酸氧化酶 氨基酸+水+氧氨基酸+水+辅酶 氨基酸脱氢酶 含氧酸+氨+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的速度，测算出肌酐的浓度大小测定结果。
2. —种肌酐诊断试剂(盒)，主要成分包括缓冲液 稳定剂 辅酶肌酐脱亚胺酶20-1— 1——500,1/L -4000mmol/L -6mmol/L1000 1000 10001— 1—-50mmol/L -50mmol/L过氧化氢试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会 反应作用。其特征在于试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂(盒)，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、肌酐脱亚胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶、含氧酸、过氧化 氢组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂(盒)，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、肌酐脱亚胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶、含氧酸、过氧化 氢组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、含氧酸、过氧化氢组成；试剂2，由缓冲 液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶组成。辅酶、肌酐脱亚胺酶、氨基酸 氧化酶、氨基酸脱氢酶、含氧酸、过氧化氢在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂(盒)，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、肌酐脱亚胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶、含氧酸、过氧化 氢组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶、含氧酸、过氧化氢组成；试剂2，由缓冲 液、稳定剂、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶组 成。辅酶、肌酐脱亚胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶、含氧酸、过氧化氢在试剂1、试剂2 或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂(盒)，其特征在于还包括稳定剂l-4000mmo1/ L或O. 1% _100%体积比。所述稳定剂为甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶循环扩增法、酶比色法及酶联法技术的肌酐诊断试剂(盒)，同时本发明还涉及测定肌酐浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂(盒)主要成分包括缓冲液、辅酶、含氧酸、过氧化氢、肌酐脱亚胺酶、氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的速度，从而测算出肌酐的浓度大小。
文档编号G01N33/48GK101762504SQ20081024420
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月10日 优先权日2008年12月10日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司