专利名称：肌酐诊断试剂盒及肌酐浓度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种肌酐诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定肌酐浓 度的测定方法，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
测定肌酐主要有化学测定法(Jaffe法)、酶法、高效液相层析法和 毛细管电泳法等。
化学测定法成本低廉，操作简便，是目前国内测定肌酐最常用的方 法之一。标本中的肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌酐复合 物。此法的缺点是特异性不高，维生素C、丙酮、乙酰乙酸、甲基多 巴以及高浓度葡萄糖、蛋白质和一些抗生素如青霉素G、头孢西丁、 头孢唑啉等也能与碱性苦味酸反应生成红色。
高效液相层析法(HPLC),肌酐在弱酸性环境中带正电荷，通过阳 离子交换层析柱可与其他成分很好分离，在234nm测定其光吸收。此 法分析的精密度高、特异性好，但本法不适于大批量临床标本分析， 通常作为肌酐测定的参考方法，用于评价市售肌酐测定的试剂盒和某 些科研目的。检索发现，申请号为90106198.0、申请日为1990.12.18 的中国专利申请公开了用高效液相色谱直接测定人尿中假尿嘧啶核苷 (简称假尿苷)，再通过分光光度法同时测出肌酐，分别用假尿苷和假
尿苷/肌酐作为鼻咽癌和肺癌的标志物。不过这个专利和本申请无关。 毛细管电泳法，血清标本用高速离心作预处理，尿液标本可用低速
离心，除去有形成分，上清液用胶束动电毛细管电泳分离后测定235nm
处吸光度。本法测定线性范围宽，操作较为简便，但需用特殊设备和
进行血清标本的预处理，临床常规使用困难。
酶学测定法主要有肌酐脱亚胺酶(Creatinine deiminase )和肌
酐酶(Creatininase)两大类。
检索发现，申请号为02139298.6、申请日为2002. 11. 15的专利
申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰胺辅酶配制的测定试剂。该发 明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰胺辅酶或 其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰胺辅酶或其类似物及其相应 的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物 -NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物 缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟 酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可 达到测定样本中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、 氨、肌酐和二氧化碳等的目的。该发明的特点在于为丙氨酸氨基转移 酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试 剂和二氧化碳试剂等的测试提供一个内源合成丙氨酸氨基转移酶试
剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和 二氧化碳试剂等反应所需要的底物一还原型烟酰胺辅酶。其缺点之一 为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消 了部分丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酑 和二氧化碳等的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二
是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够 的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带 来很大的不便。
据申请号为02139298.6、申请日为2002. 11. 15的专利介绍，该 系统由于不断生成测定所需的NADH或NADPH，从而大大提高了试剂的 稳定性，并大大降低试剂的生产成本。其实在试剂中加入NADH或NADPH 的稳定剂已经不是困难或增加成本的问题，反而比在试剂中增加一个 反应系统要经济得多。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量还原型 烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定 肌酐浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的肌酐诊断 试剂盒，采用该试剂盒不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生 化分析仪上进行肌酐浓度的测定，而且测定速度快、准确度高，因而 可以得到切实的推广应用。
本发明肌酐浓度测定方法原理如下-
肌酐+水肌酐脱亚胺酶N-甲基海因+氨离子 氨离子+丙酮酸+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶 L-丙氨酸
+水+辅酶
这种方法应用肌酐脱亚胺酶(creatinine deaminase ; EC 3.5.4.21 )(偶) 联丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4丄1)酶促反应终点 比色法。肌酐脱亚胺酶酶解肌酐反应产生氨离子，再通过(偶)联合
丙氨酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧 化成为氧化型辅酶(在340nrn处没有吸收峰)，从而得以测定还原型 辅酶在340nm处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的 程度，可以测算肌酐浓度的大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明肌酐诊断试
剂盒较为理想
缓冲液 10Ommoi/L
稳定剂 5Ommol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
丙酮酸 16mmol/L
肌酐脱亚胺酶 6000 U/L
丙氨酸脱氢酶 10000 U/L
本发明的肌酐诊断试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、 还原型辅酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂-试剂1
缓冲液、稳定剂、丙酮酸、还原型辅酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶。 丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、还原型辅酶在试剂1或试
剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解 后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。 也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸。 试剂3
缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶。 丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、还原型辅酶在试剂l、试 剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前 加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定肌酐浓度的方法，其还原 型可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的肌酐诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 丙酮酸
肌酐脱亚胺酶 丙氨酸脱氢酶
0.25 mmol/L 16 mmol/L 6000 U/L 画00U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测肌酐 样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，检测 方法为终点法，延迟时间O分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出肌酐浓 度的大小。 实施例二
本实施例的肌酐诊断试剂为双试剂，包括
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
丙酮酸
10Ommol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 12 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 100mmol/
稳定剂
肌酐脱亚胺酶 丙氨酸脱氢酶
50 mmol/L 8000 U/L 8000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始 吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测肌酐 样品与试剂l、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降 反应)，检测方法为终点法，延迟时间O分钟左右，检测时间5分钟左 右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出肌酐的 浓度大小。 实施例三
本实施例的肌酐诊断试剂为三试剂，包括
试剂1
缓冲液 稳定剂 还原型辅酶
画mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L
试剂2
缓冲液 稳定剂 丙酮酸
励mmol/L 50 mmol/L 20 mmol/L试剂3
缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
肌酐脱亚胺酶 4000 U/L
丙氨酸脱氢酶 16000U/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定肌酐浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应 时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7,测试主波长340nm,测试副波长 405nm，被测肌酐样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5， 反应方向为负反应(下降反应)，检测方法为终点法，延迟时间0分钟 左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出肌酐浓 度的大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好、不受内外源 物质的污染，便于推广应用。
权利要求
1.一种肌酐浓度测定方法，其方法原理如下id="icf0001" file="A2006100968810002C1.gif" wi="132" he="26" top= "37" left = "38" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的大小程度，测算出肌酐浓度大小测定结果。
2. —种肌酐诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L 稳定剂 1——50mmol/L还原型辅酶 0.1——0.35 mmol/L丙酮酸 2——30mmol/L肌酐脱亚胺酶 2000——12000 U/L丙氨酸脱氢酶 4000——20000 U/L其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、还原 型辅酶组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、还原型辅酶组成双剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸、还原 型辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、肌酑脱亚胺酶、丙氨酸 脱氢酶组成。丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、还原型辅酶 在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述肌酑诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、还原 型辅酶组成多剂试剂；试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶组 成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸组成；试剂3，由缓冲液、 稳定剂、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶组成。丙酮酸、肌酐脱亚胺 酶、丙氨酸脱氢酶、还原型辅酶在试剂l、试剂2或试剂3中的位 置可以不限。
6. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定 剂14000 mmol/L或0.P/。-100。/。体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的肌酐诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定肌酐浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、丙酮酸、肌酐脱亚胺酶、丙氨酸脱氢酶、还原型辅酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的大小程度，从而测算出肌酐的浓度。采用本发明完全可以通过紫外/可见光分析仪器得出所需的测定结果。
文档编号G01N33/70GK101169418SQ20061009688
公开日2008年4月30日 申请日期2006年10月24日 优先权日2006年10月24日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司