专利名称：肌酐诊断试剂盒及肌酐浓度的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种肌酐诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定肌酐浓
度的方法，属于医学检验测定技术领域。
祖旦肚士 冃豕汉不
测定肌酐主要有化学测定法(Jaffe法)、酶法、高效液相层析法 和毛细管电泳法等。
化学测定法一一成本低廉，操作简便，是目前国内测定肌酐最常 用的方法之一。标本中的肌酐与苦味酸盐作用生成黄红色的苦味酸肌 酐复合物。此法的缺点是特异性不高，因为维生素C、丙酮、乙酰乙 酸、甲基多巴以及高浓度葡萄糖、蛋白质和一些抗生素如青霉素G、 头孢西丁、头孢唑啉等也能与碱性苦味酸反应生成红色。
高效液相层析法(HPLC)——肌酐在弱酸性环境中带正电荷，通 过阳离子交换层析柱可与其他成分很好分离，在234nm测定其光吸收。 此法分析的精密度高、特异性好，但本法不适于大批量临床标本分析， 通常仅作为肌酐测定的参考方法，用于评价市售肌酐测定的试剂盒和 某些科研目的。
毛细管电泳法——血清标本用高速离心作预处理，尿液标本可用 低速离心，除去有形成分，上清液用胶束动电毛细管电泳分离后测定 235nm处吸光度。本法测定线性范围宽，操作较为简便，但需用特殊 设备和进行血清标本的预处理，临床常规使用困难。
酶学测定法^主要有肌酐脱亚胺酶(Creatinine deiminase ) 和肌酐酶(Creatininase)两大类。检索发现，申请号为02139298.6、
申请日为2002.11.15的专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰
胺辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反 应所需的还原型烟酰胺辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟
酰胺辅酶或其类似物及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系 统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，
将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰胺辅酶或其 类似物。当被还原的还原型烟酰胺辅酶或其类似物达到一定的浓度时， 该发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中丙氨酸氨基转移酶、天门 冬氨酸氨基转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的目的。该发明的 特点在于为丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿 素养试剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等的测试提供一个内源 合成丙氨酸氨基转移酶试剂、天门冬氨酸氨基转移酶试剂、尿素养试 剂、氨试剂、肌酐试剂和二氧化碳试剂等反应所需要的底物一还原型 烟酰胺辅酶。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟 酰氨辅酶的同时，也抵消了部分丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基 转移酶、尿素、氨、肌酐和二氧化碳等的活性，造成试剂测试的准确 性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段 时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓 不济急的结果，给测试带来很大的不便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶循环扩增法 (Enzymatic Recycling Method)、酶比色》去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成 吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye),所导 致在400—700nm波长处吸光度的上升，得以测定肌酐浓度的方法，
同时，本发明还将给出用以实现该方法的肌酐诊断试剂盒，采用该试
剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行肌酐浓
度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实
的推广应用。
本发明肌酐浓度测定方法原理如下
肌酐+水+ H+肌酐脱亚胺酶 N-甲基海因+氨离子
氨离子+ a-酮戊二酸+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸 ' +辅酶+水
谷氨酸+水+氧谷氨酸氧化酶氨离子+ a-酮戊二酸+
过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
这种方法应用肌酐脱亚胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)将 肌酐酶解产生氨。
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3或 EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11) 使氨不断地被重复循环利用，并同时不断地循环扩增产出过氧化氢。
过氧化物酶将过氧化氢与还原型色原体组合作用，最终将无色的还 原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器， 在400—700nm (根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染 料，吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)， 含量高低的光吸收大小，通过测量400~700nm (根据还原型色原体组 合的不同而定)处吸光度上升的速度，得出肌酐浓度大小测定结果。 实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考 虑，如下成分关系的本发明肌酐诊断试剂盒较为理想
缓冲液 稳定剂 还原型辅酶 肌酐脱亚胺酶
谷氨酸氧化酶
a-酮戊二酸 过氧化物酶 还原型色原体组合A 抗干扰剂
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 5000 U/L 100000U/L 8000 U/L 16 mmol/L 30000 U/L 6 mmol/L 30 mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任-
个组合
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基""N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺
4- 氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒 N,N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒 2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒 3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3,5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒 双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒
2,2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
本发明的肌酐诊断试剂盒可以是单剂，包括 缓冲液、稳定剂、OC-酮戊二酸、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸 脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、抗干扰剂。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、a-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、 过氧化物酶、还原型色原体组合、抗干扰剂。 试剂2
缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸氧化酶。 a-酮戊二酸、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨 酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂1或试剂2中的位
置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、Ot-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、抗干扰剂。
试剂3
缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸氧化酶。
a-酮戊二酸、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨 酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合在试剂l、试剂2或试剂3 中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的肌酐诊断试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
肌酐脱亚胺酶 8000 U/L
谷氨酸脱氢酶 150000 U/L
谷氨酸氧化酶 8000 U/Lot-酮戊二酸 16mmol/L 过氧化物酶 30000 U/L
4-氨基抗砒 2 mmol/L
石碳酸 10mmol/L 试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂； 使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37X:，反应时间IO分钟，测 试主波长505nm，测试副波长600nm，被测样品与试剂的体积比例为 1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间 大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于 生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的速度，从而测算出肌 酐的浓度大小。 实施例二
本实施例的肌酐诊断试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液10Ommol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
谷氨酸脱氢酶 120000 U/L
ot-酮戊二酸 16mmol/L 过氧化物酶 30000 U/L
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L 缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
肌酐脱亚胺酶 4000 U/L
谷氨酸氧化酶 8000 U/L
4-氨基抗砒 0.6 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C,反应时间10分钟，测试 主波长546nm，测试副波长600nm，被测样品与试剂的体积比例为1/20， 反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约l 分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化 分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的速度，从而测算出肌酐的 浓度大小。
实施例三肌酐诊断试剂为三试剂，包括-试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
还原型辅酶
ot-酮戊二酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙
0.25 mmol/L 100000U/L 16 mmol/L 0.6 mmol/L试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
试剂3
稳定剂
过氧化物酶
双甲基苯胺
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
肌酐脱亚胺酶 谷氨酸氧化酶
50 mmol/L 40000 U/L 2 mmol/L
100mmol/L 50 mmol/L 5000 U/L 8000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37。C，反应时间10分钟，测试
主波长578nm，测试副波长660nm，被测样品与试剂的体积比例为1/30，
反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为速率法，延迟时间大约l
分钟左右，检测时间2分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于
生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的速度，从而测算出肌
酐的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原 型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实
施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过可见光分 析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好。
权利要求
1.一种酶循环扩增法(Enzymatic Recycling Method)的肌酐浓度测定方法，其方法原理如下肌酐+水+H+ 肌酐脱亚胺酶 N-甲基海因+氨离子氨离子+α-酮戊二酸+还原型辅酶 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸+辅酶+水谷氨酸+水+氧 谷氨酸氧化酶 氨离子+α-酮戊二酸+ 过氧化氢过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亚胺色原+水将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收速度，得出肌酐浓度大小测定结果。肌酐脱亚胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)作为作用酶，功能为产生氨。谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3或EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、EC1.4.3.11)作为循环酶，将氨不断地被重复循环利用，并同时不断地扩增产生过氧化氢。过氧化物酶作为显色酶，将过氧化氢与还原型色原体组合作用发生显色反应。
2. —种肌酐诊断试剂盒，主要成分包括缓冲液 20——500 mmol/L稳定剂还原型辅酶肌酐脱亚胺fo.i-50 mmol/L-0.35 mmol/L200--50000 U/L2000——500000 U/L2000——500000 U/L2-画20 mmol/L500~^500000 U/L0.1"——20mmol/L1-50 mmol/L谷氨酸氧化酶 a-酮戊二酸 过氧化物酶 还原型色原体组合 抗干扰剂其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、a-酮戊二酸、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶(Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、过氧化物酶(EC 1.11丄7)、还原型色原体组合及抗干扰剂组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于 由缓冲液、稳定剂、a-酮戊二酸、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶(Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4丄2、 EC 1.4丄3、 EC 1.4丄4)、谷氨酸氧化酶 (Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、过氧化物酶(EC1.11丄7)、还原型色原体组合及抗干扰剂组成双剂试剂；试剂1， 由缓冲液、稳定剂、a-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶、过 氧化物酶、还原型色原体组合及抗干扰剂组成；试剂2，由缓冲液、 稳定剂、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸氧化酶及抗干扰剂组成。a-酮戊二 酸、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、 过氧化物酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、a-酮戊二酸、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶 (Creatinine deaminase EC 3.5.4.21)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase EC 1.4.1.2、 EC 1.4.1.3、 EC 1.4.1.4)、谷氨酸氧化酶 (Glutamate oxidase EC 1.4.3.7、 EC 1.4.3.11)、过氧化物酶(EC 1.11丄7)、还原型色原体组合及抗干扰剂组成多剂试剂；试剂1， 由缓冲液、稳定剂、oc-酮戊二酸、还原型辅酶、谷氨酸脱氢酶组成； 试剂2，由缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合及抗 干扰剂组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸 氧化酶组成。a-酮戊二酸、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸脱 氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶及抗干扰剂在试剂l、试剂2或 试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于还包括稳定 齐廿1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
7. 根据权利要求2所述肌酐诊断试剂盒，其特征在于所述还原型色 原体组合可以是下列28个组合中的任一个组合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-双乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 双氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-双氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 双氯-2-羟基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻哇酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙双甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻挫-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-双乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒2.4- 双氯石碳酸4-氨基抗砒2，4,6-仨溴-3-羟基-苯磺酸4-氨基抗砒3.5- 双氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒双甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本发明涉及一种酶循环扩增法的肌酐诊断试剂盒，同时本发明还涉及测定肌酐浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、α-酮戊二酸、还原型辅酶、肌酐脱亚胺酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合、稳定剂及抗干扰剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出肌酐浓度的大小。
文档编号G01N21/78GK101097198SQ20061008558
公开日2008年1月2日 申请日期2006年6月26日 优先权日2006年6月26日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司