一株芳氧苯氧丙酸类除草剂降解菌株及其应用的制作方法

本发明属于生物处理技术领域，涉及一株芳氧苯氧丙酸类除草剂降解菌株及其应用。

背景技术：

芳氧苯氧丙酸类（AOPP）除草剂主要用于防除禾本科杂草，因其高效、低毒而在我国及世界作物田被广泛应用。精噁唑禾草灵是该类除草剂中使用量最大的品种，2003年和2009年的销售额分别为2.5亿美元和2.8亿美元，占该类除草剂总销售量的31.2%，位于全球除草剂销量榜第七位。AOPP除草剂在应用过程中仅有小部分药剂可以附着于植物上发挥作用，其余大部分残留在大气、土壤和水等生态环境中。尽管AOPP除草剂的毒性相对较低，但大量研究表明AOPP除草剂对水生生物表现为高毒性，过量残留已经对农业生产、土壤生态、人类健康以及进出口贸易带来巨大威胁。

生物降解是农药在环境中的一类重要转化过程。微生物由于大量存在于自然界、并且具有种类繁多、繁殖迅速和对环境适应性强等特点，在农药的生物降解过程中起到了重要作用。当前研究者已分离到一些能降解AOPP除草剂的微生物，主要以降解精噁唑禾草灵为主且降解能力普遍较低：Gennari等首次报道了一组微生物菌群在60天内将30 mg·L^-1精噁唑禾草灵完全降解；Hoagland等分离了四株荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescensBD4-13，RA-2和UA5-40和P. putida M-17在 7天内最高仅能降解5 mg·L^-1精噁唑禾草灵；宋立岩等从精噁唑禾草灵生产废水处理系统中富集筛选到具有较高降解能力的菌株Alca1igenes sp. H，该菌株10天可将初始浓度为100 mg·L^-1的精噁唑禾草灵分别降解45.8%；侯颖等从被精噁唑禾草灵污染的土壤中分离到一株红球菌Rhodococcus sp. T1，该菌株在5d内将100 mg·L^-1的精噁唑禾草灵降解80%。因此，筛选到能够高效广谱降解AOPP除草剂的菌株，对降解基因资源的开发利用和环境污染修复非常具有现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的是针对AOPP除草剂残留带来生态污染，而现有微生物对AOPP除草剂降解能力弱、降解谱窄的问题，提供一种高效广谱降解AOPP除草剂的微生物。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案实现：

一株芳氧苯氧丙酸类除草剂降解菌株，所述微生物为不动杆菌属，其分类命名为Acinetobacter sp.VL-2，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCC NO：M 2016374，保藏日期为：2017年7月4日，保藏地址为：中国. 武汉. 武汉大学。

本发明所述的菌株Acinetobacter sp.VL-2，其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本发明所述的Acinetobacter sp.VL-2筛选方法为：用无机盐培养基，以精噁唑禾草灵为唯一碳源，对农药厂污水排放口处污泥中具有其降解能力的微生物进行分离纯化。

具体地，以农药厂污水排放口处污泥作为分离材料，利用含有100 mg·L^-1精噁唑禾草灵的无机盐培养基作为介质，连续富集驯化能利用精噁唑禾草灵生长的菌株，将富集培养基稀释涂布至含有100 mg·L^-1精噁唑禾草灵的无机盐固体培养基，30℃静止培养，挑去能在该平板上形成透明圈的微生物进行纯化获得纯培养，即为本发明所获取的菌株Acinetobacter sp.VL-2。利用紫外扫描验证该纯培养对精噁唑禾草灵的降解能力。

具体地，所述的无机盐培养基配方为：NH₄NO₃ 1.0 g·L^-1，KH₂PO₄ 0.5 g·L^-1，K₂HPO₄ 1.5 g·L^-1，NaCl 1.0 g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.1 g·L^-1，pH 7.0，固体培养基需加入琼脂20.0 g·L^-1，121℃灭菌20 min，使用前添加终浓度100 mg·L^-1过滤除菌的精噁唑禾草灵作为碳源。

本发明所述的芳氧苯氧丙酸类除草剂降解菌株的生理生化鉴定和16S rDNA序列鉴定结果如下：

生理生化鉴定：革兰氏阴性菌，细胞呈短杆状，无鞭毛，无荚膜，无芽孢；菌落呈乳白色到微黄色，菌落突起呈圆形，有光泽，不透明，容易挑取；接触酶、V-P试验、柠檬酸盐利用、明胶水解、乳糖发酵、果糖发酵、阿拉伯糖发酵等均为阳性；对氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、庆大霉素、壮观霉素、链霉素、四环素均不敏感。其生理生化鉴定的结果与伯杰氏细菌鉴定手册中不动杆菌属的特征最为接近。

16S rDNA序列鉴定：利用引物27F：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和1492R：5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`扩增该菌株的16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌Escherich coli DH5α获得重组微生物E. coli DH5α （pMD19T-16S），将所获得的重组微生物外源片段进行测序，在分子水平上将其鉴定至不动杆菌属，命名为Acinetobacter sp.VL-2。

本发明的另一目的是提供该菌株的最适生长条件，为该菌株的大规模发酵生产提供理论基础。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

将Acinetobacter sp. VL-2菌落接种至液体LB培养基，分别于20，25，30，37，42℃；pH 4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0；盐浓度 0 g·L^-1，2 g·L^-1，4 g·L^-1，6 g·L^-1，8 g·L^-1，10 g·L^-1，12 g·L^-1，16 g·L^-1，20 g·L^-1；培养基装液量10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%条件下振荡培养12h后测定OD600值，确定最适发酵条件，制备高效降解AOPP微生物菌剂。

具体地，所述的LB培养基配方为：蛋白胨10.0 g·L^-1，酵母粉5.0 g·L^-1， NaCl 10.0 g·L^-1， pH 7.0，121℃灭菌20 min。

所述的芳氧苯氧丙酸类除草剂降解菌株的最适生长条件，该菌株在LB培养基中最适生长温度在25-42℃之间，最适生长pH为7.0，最适生长盐浓度为4 g·L^-1，好氧发酵。

本发明的又一目的是提供该菌株的应用。该菌株可用于AOPP除草剂造成环境污染的生物修复。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

（1）菌株VL-2种子液培养：从LB平板上挑取菌株VL-2单菌落，分别接种于3 mL 液体LB培养基中于30℃，摇床180 r·min^-1培养12 h。然后将该菌株的培养液转接到20 mL新鲜的液体LB培养基中，继续培养12 h。6000 r·min^-1离心3 min，收集菌体，用灭菌的无机盐培养基洗涤一次后，制成OD_600nm=1.0的菌悬液，即种子液。

（2）菌株VL-2降解精噁唑禾草灵的动力学：在精噁唑禾草灵终浓度为100 mg/L的无机盐培养基中，按5%接种量接入OD_600nm=1.0菌株VL-2种子液，于30℃，180 r·min^-1 振荡培养，每隔24 h 取样一次，测定OD_600nm和精噁唑禾草灵的残留浓度。

（3）温度和pH对菌株VL-2降解精噁唑禾草灵的影响：在精噁唑禾草灵终浓度为100 mg/L的无机盐培养基中，按5%接种量接入种子液，分别于20℃，25℃，30℃，37℃，42℃，pH 7，180 r·min^-1振荡培养；分别于初始pH 4、5、6、7、8、9、10、11，30℃、180 r·min^-1 振荡培养，测定温度和pH对菌株VL-2降解精噁唑禾草灵的影响。

（4）底物初始浓度和接种量对菌株VL-2降解精噁唑禾草灵的影响：在精噁唑禾草灵终浓度为100 mg/L的无机盐培养基中，分别按1%、5%、10%、20%的接种量接入种子液于30℃，180 r·min^-1 振荡培养；分别在精噁唑禾草灵终浓度为25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的无机盐培养基中，按5%接种量接入种子液，于30℃，180 r·min^-1 振荡培养，测定底物初始浓度和接种量对菌株VL-2降解精噁唑禾草灵的影响。

（5）菌株VL-2对其他AOPP除草剂的降解能力测定：分别在终浓度为100 mg/L的含氰氟草酯，炔草酯，精喹禾灵，高效氟吡甲禾灵的无机盐培养基中，按5%接种量接入种子液，于30℃，180 r·min^-1 振荡培养120 h，测定菌株VL-2对其他AOPP除草剂的降解能力。

本发明以农药厂污水排放口污泥为分离材料，分离纯化到一株可以高效广谱的降解AOPP类除草剂的菌株，对降解基因资源的开发利用和农药污染土壤修复非常具有现实意义。

与现有技术相比，该菌株对AOPP除草剂的降解是高效广谱的，对100 mg/L的精噁唑禾草灵在120 h降解率达到98%以上，降解性能明显优于国内外的精噁唑禾草灵降解菌株。此外，该菌株还可以降解其他AOPP除草剂，对氰氟草酯，炔草酯，精喹禾灵，高效氟吡甲禾灵的降解率均可达到90%以上，降解谱有丰富的多样性，适合应用在AOPP除草剂污染土壤的生物治理上。

附图说明

图1是菌株VL-2降解精噁唑禾草灵效果图。

图2是菌株VL-2降解精噁唑禾草灵的产物鉴定质谱图。

图3是菌株VL-2降解精噁唑禾草灵的机制示意图。

图4是菌株VL-2的电镜图片。

图5是菌株VL-2的系统发育树。

图6是精噁唑禾草灵降解曲线及菌株VL-2生长曲线。

图7a是温度对菌株VL-2降解精噁唑禾草灵的影响示意图。

图7b是pH值对菌株VL-2降解精噁唑禾草灵的影响示意图。

图7c是底物初始浓度对菌株VL-2降解精噁唑禾草灵的影响示意图。

图7d是接种量对菌株VL-2降解精噁唑禾草灵的影响示意图。

图8是菌株VL-2降解其他AOPP除草剂的示意图。

本发明所述的生物材料，其分类命名为Acinetobacter sp. VL-2，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏编号为：CCTCC NO：M 2016374，保藏日期为：2016年7月4日，保藏地址为：中国. 武汉. 武汉大学。

具体实施方式

下面结合附图说明和具体实施例对本发明的技术方案做进一步描述，但不应视为对本发明保护范围的限制。下述的实施例中所使用的实验方法无特殊说明均为常规方法。下述的实施例中所使用的实验试剂耗材等无特殊说明均可从商业用途购买。

实施例1

芳氧苯氧丙酸类除草剂降解菌株Acinetobacter sp.VL-2的分离筛选：

取2 g农药厂污水排放口处淤泥样品置于100 mL 含20 mg/L精噁唑禾草灵的无机盐培养基中，于30℃、180 r·min^-1 培养5 d。用紫外扫描仪测定富集液对精噁唑禾草灵的降解情况，确定精噁唑禾草灵被降解后，将无机盐培养基中的培养液以10%的接种量接入到含50 mg/L精噁唑禾草灵的无机盐培养基中，继续富集并测定降解情况，按此方法直至精噁唑禾草灵浓度提高至100 mg/L，并传代3 次。

将具有精噁唑禾草灵降解性能的富集液经梯度稀释后涂布在以100 mg/L精噁唑禾草灵为唯一碳源的无机盐培养基平板上，于30℃培养箱中分别培养5 d。将平板上长出的菌落形态不同的单菌落分别划线于LB平板纯化，并接种于以100 mg/L精噁唑禾草灵为唯一碳源的无机盐培养基中，于30℃、180 r·min^-1摇床培养5 d 后，利用高效液相色谱（HPLC）确定菌株对精噁唑禾草灵的降解能力。如图1所示，通过HPLC发现，编号为VL-2的菌株可以将精噁唑禾草灵完全转化为一种未知产物。

前述无机盐培养基配方为：NH₄NO₃ 1.0 g·L^-1，KH₂PO₄ 0.5 g·L^-1，K₂HPO₄ 1.5 g·L^-1，NaCl 1.0 g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.1 g·L^-1，pH 7.0，固体培养基需加入琼脂20.0 g·L^-1，121℃灭菌20 min，使用前添加过滤除菌的精噁唑禾草灵作为碳源。

将菌株VL-2降解精噁唑禾草灵后的培养液冷冻干燥后用2 mL的甲醇溶解，过0.22 um有机滤膜，利用质谱分析（MS）鉴定该未知产物。如图2所示，通过MS分析发现，该未知产物的m^-/z=332，具有一个m^-/z=334的同位素峰，且两个峰之间的丰度比值为3:1，这说明该未知产物中含有一个卤素原子。根据精噁唑禾草灵的化学结构，将该未知产物鉴定为精噁唑禾草灵酸，即菌株VL-2对精噁唑禾草灵的降解是通过水解其酯键实现的（图3）。

实施例2

芳氧苯氧丙酸类除草剂降解菌株Acinetobacter sp.VL-2的鉴定及其生长特性：

对菌株VL-2进行16S rDNA鉴定：

利用引物27F：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`和1492R：5`-TACCTTGTTACGACTT -3`扩增菌株VL-2的16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌Escherich coli DH5α获得重组微生物Escherich coli DH5α （pMD19T-16S），将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平上将菌株VL-2鉴定至不动杆菌属。

菌株VL-2的生长特性：

Acinetobacter sp.VL-2为革兰氏阴性菌，在LB平板上生长很快，30℃，12 h可形成直径为3 mm的微黄色菌落，菌落边缘整齐，有光泽，突出，湿润，光滑，不透明；接触酶、V-P试验、柠檬酸盐利用、明胶水解、乳糖发酵、果糖发酵、阿拉伯糖发酵等均为阳性；对氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、庆大霉素、壮观霉素、链霉素、四环素均不敏感；如图4所示，其电镜图片中菌体呈短杆状，无鞭毛，无荚膜，无芽孢，大小为0.8×1.5μm，基于其16S rDNA序列以及生理生化特征，菌株VL-2被鉴定为Acinetobacter属（图5）。

实施例3

本实施例说明菌株VL-2的最适生长条件。

将Acinetobacter sp.VL-2菌落接种至液体LB培养基，分别于20，25，30，37，42℃；pH 4，5，6，7，8，9，10，11；盐浓度 0 g·L^-1，2 g·L^-1，4 g·L^-1，6 g·L^-1，8 g·L^-1，10 g·L^-1，12 g·L^-1，16 g·L^-1，20 g·L^-1；培养基装液量10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%条件下振荡培养12h后测定OD600值，确定最适发酵条件。

其中，所述的LB培养基配方为：蛋白胨10.0 g·L^-1，酵母粉5.0 g·L^-1， NaCl 10.0 g·L^-1， pH 7.0，121℃灭菌20 min。

菌株VL-2的最适生长温度为30℃，在25-42℃之间均可以很好的生长，但在较低温度（20℃和25℃）时，其生长则受到轻微抑制。菌株VL-2在pH为5-11之间时，生长良好，其最适生长pH为7；当pH低于4时，其生长就受到明显抑制，菌株VL-2生长时随着摇瓶装液量的增加其生长量下降，表明菌株VL-2也是好氧型微生物。菌株VL-2在NaCl浓度为0.4%时生长良好；当NaCl浓度为1.2%时其生长即受到明显的抑制。

实施例4

本实施例说明芳氧苯氧丙酸类除草剂降解菌株Acinetobacter sp.VL-2的降解特性：

从LB平板上挑取菌株VL-2单菌落，分别接种于3 mL 液体LB培养基中于30℃，摇床180 r·min^-1培养12 h。然后将该菌株的培养液转接到20 mL新鲜的液体LB培养基中，继续培养12 h。6000 r·min^-1离心3 min，收集菌体，用灭菌的无机盐培养基洗涤一次后，制成OD_600nm=1.0的菌悬液，即种子液。

在精噁唑禾草灵终浓度为100 mg/L的无机盐培养基中，按5%接种量接入OD_600nm=1.0菌株VL-2种子液，于30℃、180 r·min^-1 振荡培养，每隔24 h 取样一次，测定OD_600nm和精噁唑禾草灵的浓度。

由图6可以看出，菌株VL-2接种到培养基中24 h，就开始降解精噁唑禾草灵，而没有明显的延滞现象；之后降解速率逐渐增加，到120 h就已将100 mg/L的精噁唑禾草灵基本降解完全。另外，从图中还可以看出，随着精噁唑禾草灵的降解，菌株VL-2的生长量逐渐增加；当精噁唑禾草灵被降解完全后，菌株VL-2的生长量开始下降。该结果表明菌株VL-2可以利用精噁唑禾草灵作为唯一碳源进行生长。

菌株VL-2在37℃时，对精噁唑禾草灵的降解能力最强；而在温度高于或低于37℃时，精噁唑禾草灵的降解率就受到明显抑制；随着温度不断降低，菌株对精噁唑禾草灵的降解能力逐渐减弱，如图7a所示。菌株VL-2在降解精噁唑禾草灵时对pH的适应范围很宽，在pH 6-10之间均具有很好的效果；即使在pH为4时，精噁唑禾草灵的降解率也可以达到52%，如图7b所示。菌株VL-2对精噁唑禾草灵的降解速率随着底物浓度的增加而降低。当精噁唑禾草灵初始浓度为20 mg/L时，其在72 h的降解率为98.5%；而当精噁唑禾草灵初始浓度为100 mg/L时，其在120 h的降解率仍然可以达到95.3%，说明该菌株对精噁唑禾草灵具有高效的降解效率，如图7c所示。随着接种量的增大，精噁唑禾草灵的降解速率明显增加。当接种量为1%时，精噁唑禾草灵在72 h的降解率为20.1%；而当接种量为10%和20%时，精噁唑禾草灵在96 h时即基本降解完全，如图7d所示。

菌株Acinetobacter sp.VL-2也可以降解氰氟草酯，炔草酯，精喹禾灵，高效氟吡甲禾灵等AOPP除草剂。如图8所示，其对多种AOPP除草剂在120 h内降解率均达到90%以上，特别对炔草酯的降解率极高，在72 h内降解效率即达到80%以上。表明菌株VL-2降解谱有丰富的多样性，适合应用在AOPP除草剂污染土壤的生物治理上。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一株芳氧苯氧丙酸类除草剂降解菌株及其应用

<130> xb16101201

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Artificial

<400> 1

cacatgcaag tcgagcgggg gaaggtagct tgctactgga cctagcggcg gacgggtgag 60

taatgcttag gaatctgcct attagtgggg gacaacatct cgaatgggat gctaataccg 120

catacgtcct acgggagaaa gcaggggatc ttcggacctt gcgctaatag atgagcctaa 180

gtcggattag ctagttggtg gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatctgt agcgggtctg 240

agaggatgat ccgccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300

tggggaatat tggacaatgg agggaaccct gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg 360

ccttatggtt gtaaagcact ttaagcgagg aggaggctac tttagttaat acctagagat 420

agtagacgtt actcgcagaa taagcaccgg ctaactctgt gccagcagcc gcggtaatac 480

agagggtgcg agcgttaatc ggatttactg ggcgtaaagc gtgcgtaggc ggcttattaa 540

gtcggatgtg aaatccccga gcttaacttg ggaattgcat tcgatactgg tgagctagag 600

tatgcgagag gatggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tctggaggaa 660

taccgatggc gaaggcagcc atctggccta atactgacgc tgaggtacga aagcatgggg 720

agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa cgatgtctac tagccgttgg 780

ggcctttgag gctttagtgg cgcagctaac gcgataagta gaccgcctgg ggagtacggt 840

cgcaagacta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt 900

taattcgatg caacgcgaag aaccttacct ggccttgaca tactagaaac tatccagaga 960

tggattggtg ccttcgggaa tctagataca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1020

gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccta ttccttactt gccagcattt 1080

cggatgggaa ctttaaggat actgccagtg acaaactgga ggaaggcggg gacgacgtca 1140

agtcatcatg gcccttacgg ccagggctac acacgtgcta caatggtcgg tacaaagggt 1200

tgctacacag cgatgtgatg ctaatctcaa aaagccgatc gtagtccgga ttggagtctg 1260

caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagaatgc cgcggtgaat 1320

acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtttgttg caccagaagt 1380

agctagccta actgcagaga gggcggt 1407