利用耐乙醇片球菌复合发酵生产含GABA果蔬酵素的方法与流程

本发明涉及一种利用耐乙醇片球菌（pediococcusethanolidurans）复合发酵生产含gaba果蔬酵素的方法，属于发酵型功能饮品加工领域。

背景技术：

酵素（enzyme）又称为“酶”，是一种由氨基酸组成的具有特殊生物活性的物质，是维持机体正常功能以及消化食物、修复组织等生命活动的一种必需物质。2016年中国生物发酵产业协会针对酵素制定了《酵素产品分类导则》，按生产工艺分为纯种发酵酵素、群种发酵酵素及复合发酵酵素。纯种发酵工艺指以动物、植物、菌类等为原料，由人工培养的有明确分类名称的微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的酵素产品。群种发酵工艺，即自然发酵工艺，指以动物、植物、菌类等为原料，由特定自然环境中的微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的酵素产品。复合发酵工艺指以动物、植物、菌类等为原料，以纯种发酵和群种发酵两种工艺共同制得的含有特定生物活性成分的酵素产品。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，简称gaba），又称4-氨基丁酸、氨酪酸、哌啶酸，是一种普遍存在的非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质。它由谷氨酸脱羧酶（gad）催化l-谷氨酸发生不可逆的α-脱羧反应而生成。它具有多种生理功能，如调节血压、治疗癫痫、促进细胞新陈代谢、保护肝脏、促进生长激素分泌、预防肥胖、促进酒精代谢等功效。目前gaba主要生产方法包括化学合成和生物合成。化学合成过程中所用化学溶剂具有毒性和腐蚀性，产品中副产物多，缺乏安全性；相反，生物合成生产过程条件温和、环境污染较低，且产品中副产物少、安全性高。因此利用微生物生产gaba，不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。2009年我国卫生部批准希氏乳杆菌发酵生产的gaba为新资源食品，可用于普通食品及保健食品的生产。

在我国的专利及文献中有利用微生物发酵生产gaba的方法，如乳酸乳球菌(专利号zl201310486474.7)、短乳杆菌(专利号zl200510049188.x)、植物乳杆菌（专利号zl201010167058.7）、嗜热链球菌（专利号zl201410480097.0）、发酵乳杆菌(专利号zl201210136696.1）、屎肠球菌（专利号zl200910114018.3）、红色红曲霉(专利号zl201010167058.7)、酿酒酵母（专利号zl201010194431.8）等。

片球菌为有益的乳酸菌，在参与肉类、蔬菜及白酒的发酵过程中，往往会产生一些发酵食品的风味物质。刘莉萌等在文献（酿酒科技,2007,2:22-28）中报道：从不同白酒酒醅发酵窖池中分离出20株片球菌，包括耐乙醇片球菌、戊糖片球菌及窖池片球菌等，并指出窖池中片球菌种类及数量是影响白酒风味的重要因素。陈功等在文献（食品与发酵工业,2013,39(3):1-4）中研究表明耐乙醇片球菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌等乳酸菌是四川泡菜发酵的优势菌群，是影响四川泡菜风味物质及功能性的重要因素。可见，耐乙醇片球菌属于有益的乳酸菌，可用于普通食品的生产与加工。

目前市场上酵素产品，大多数采用群种自然发酵方式生产。群种自然发酵方式生产酵素过程中，发酵菌种主要来源于各种水果蔬菜自带天然酵母、乳酸菌等，属于“自然落菌式”发酵。在整个发酵过程，天然酵母将含有糖质的原料“糖化”和“酒化”，会产生大量乙醇、二氧化碳等物质。一方面乙醇可以抑制杂菌的生长，但同时也抑制了生产gaba的乳酸菌繁殖与代谢。因此，获得既能耐受乙醇，又具有生产gaba能力的发酵菌种，是解决生物发酵法生产含gaba酵素产品的关键途径。

通过上述专利文献和非专利文献的检索，但目前尚未见有关于既能耐受乙醇，又具有生产gaba能力的耐乙醇片球菌及其应用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于，利用首次筛选得到的既能耐受乙醇，又能生产gaba耐乙醇片球菌为发酵菌种，采用复合发酵方式，解决了群种自然发酵过程中产生的大量乙醇与后期发酵过程中产gaba微生物无法细胞繁殖及累积gaba的矛盾。耐乙醇片球菌既能耐受一定浓度酒精而生长繁殖，又可以利用谷氨酸脱羧酶生产gaba。通过复合发酵方式和分步控制发酵条件，既可以完成群种自然发酵周期，又能纯种发酵生产γ-氨基丁酸，达到生产含γ-氨基丁酸的果蔬酵素的目的，简化了发酵工艺、提高了设备利用率和降低了生产成本，同时提升了酵素产品的保健功能，属于发酵型功能饮品加工领域。

本发明提供利用耐乙醇片球菌复合发酵生产含gaba果蔬酵素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以新鲜刺梨、芦笋等果蔬为原料，洗净、去籽、破碎，转移至发酵罐中匀浆，加入蜂蜜后静置密封，进行群种自然发酵，获得第一发酵液；

(2)向第一发酵液接入耐乙醇片球菌cgmccno.13929，进行纯种前期发酵，然后加入谷氨酸或谷氨酸钠，进行纯种后期发酵，当发酵液中gaba含量高于200mg/l时，获得第二发酵液；

(3)将所述第二发酵液混匀后，离心、均质及灭菌后，制得含gaba果蔬酵素。

步骤（1）中所述的群种自然发酵，控制发酵温度为25-35℃，发酵时间为30-90d。

步骤（2）中所述的耐乙醇片球菌cicc6282，菌种保藏号cgmccno.13929，保藏日期为2017年3月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；纯种初期发酵时间为16-36h，控制谷氨酸或谷氨酸钠终浓度为0.5-2g/l，纯种后期发酵时间为60-180h，发酵温度为28-40℃，搅拌速度为80-150r/min，gaba浓度为200-800mg/l。

本发明的优点：

首次发现既能耐受乙醇，又能生产gaba耐乙醇片球菌。本发明方法利用耐乙醇片球菌对酒精的耐受性，可作为发酵菌种，解决了群种自然发酵过程中产生的大量乙醇与后期发酵产gaba微生物无法细胞繁殖及gaba累积的矛盾。最终通过复合发酵方式，达到生产含γ-氨基丁酸果蔬酵素的目的，简化了发酵工艺，提高了设备利用率，大大降低了生产成本。

附图说明

图1为本发明中薄层层析法检测耐乙醇片球菌产gaba。

图2为本发明中hplc法检测耐乙醇片球菌产gaba。

具体实施方式

下面将结合具体实施例来进一步对本发明作详细描述，以使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚。以下实施例仅仅用于举例说明，并不对本发明构成任何限制。

实施例1

本发明产gaba耐乙醇片球菌的分离方法，采用梯度稀释混菌法，从新疆巴音郭楞蒙古自治州博湖县发酵辣椒酱中分离。包括以下步骤：取25g的辣椒酱加入到225ml无菌生理盐水中，用涡旋振荡器摇匀，制得10^-1的稀释液，梯度稀释以制得10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的稀释液。分别取100 μl稀释液涂布于添加了2%caco3的mrs培养基，置于37℃下培养48h。挑取有溶钙圈的单菌落进行平板划线纯化，并将分离的菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cicc6282。将菌株cicc6282接种于mrs固体培养基，置于37℃培养48h，菌落呈乳白色，圆形扁平，不透明，边缘整齐；显微镜下观察菌体呈球状，大小为（0.3-0.5）μm，成对或呈四联球状排列，革兰氏染色阳性。通过接触酶实验和api50chl试剂条对菌株cicc6282的酶活性、碳源利用等生理生化特征检测，结果显示菌株cicc6282接触酶反应阴性，能够利用半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、n-乙酰葡糖胺、七叶灵、水杨苷、纤维二糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、龙胆二糖为碳源生长，不能利用其他的碳源。

菌株cicc6282的16srdnapcr扩增产物大小约为1.4kb，在genbank上的登录号为ky681774。将该序列通过ezbiocloud数据库比对，结果显示：同cicc6282的16srdna序列相似性高于97%的序列全部是片球菌属的模式菌株序列，其中菌株cicc6282同耐乙醇片球菌pediococcusethanoliduransz-9^t的16srdna序列相似性最高，为99.86%。以lactobacillusozensismizu2-1^t序列为外群，构建cicc6282与相关近缘模式菌株的系统发育树，结果显示，通过16srdna序列系统发育分析可将菌株cicc6282鉴定为片球菌属（pediococcussp.）。菌株cicc6282的phes基因pcr扩增产物大小约为400bp，在genbank上的登录号为ky681775。通过mega软件进行比对，结果显示：cicc6282的phes基因序列与耐乙醇片球菌pediococcusethanolidurans模式菌株相似性最高，为100%，而与片球菌属其余菌株phes基因序列的相似性均低于90%。以lactobacillusshenzhenensisly-73^t序列为外群，构建cicc6282与相关近缘模式菌株的系统发育树，phes基因序列系统发育分析显示，菌株cicc6282鉴定为耐乙醇片球菌pediococcusethanolidurans。通过形态学观察并结合16srdna和phes基因序列系统发育分析，结合微生物代谢类型差异，菌株cicc6282被鉴定为耐乙醇片球菌pediococcusethanolidurans。

本发明中耐乙醇片球菌产gaba定性检测，采用薄层层析法，具体步骤包括：取出发酵液，震荡均匀，8000r/min离心10min，弃沉淀，取上清。层析板为商品化10×20cm微晶纤维素玻璃板。以1mg/ml的gaba标准液、1mg/ml的l-glu标准液为对照，每组点样量为0.5μl，点样间距为1cm，点样的同时迅速用吹风机将点样处吹干，以防样品溶液扩散，影响层析效果。以正丁醇：冰醋酸：水（4：3：1，v/v）作展层剂，以0.4%茚三酮水饱和正丁醇试剂作显色剂，置于80℃烘箱内，显色10min。观察薄层层析结果，耐乙醇片球菌cicc6282发酵液中有与gaba标品相同层析距离的条带，如图1所示。

本发明中耐乙醇片球菌产gaba定量检测，采用高效液相法，具体步骤如下：取100μl发酵液上清或gaba标准液，加入800μlopa衍生液，震荡5s，过0.45μm滤膜。色谱分析条件：色谱柱：c18色谱柱（250×4.6mm，5μm）。流动相：流动相a为纯乙腈；流动相b为25mmol/l乙酸钠，用5%乙酸调ph至5.90。设置液相色谱流动相流速为1ml/min，保持柱温40℃，进样量5μl，检测波长334nm。结果表明本发明的耐乙醇片球菌发酵液中gaba含量达到了250mg/100g，如图2所示。

上述发明中的耐乙醇片球菌发酵菌，保藏号cgmccno.13929，保藏日期为2017年3月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

首先按质量比选取2份新鲜刺梨和1份芦笋，清洗、消毒，去籽、破碎，转移至发酵罐中匀浆，加入0.5份蜂蜜后静置密封，进行群种自然发酵，控制发酵温度为30℃，发酵时间为30d，得第一发酵液。其次，按10%（v/v）接种耐乙醇片球菌cgmccno.13929种子液，进行纯种初期发酵，发酵24h后，加入谷氨酸钠终浓度为0.5g/l，进行纯种后期发酵，发酵温度为37℃，搅拌速度为80r/min，当发酵液中gaba含量达到200mg/l时，获得第二发酵液。然后固液分离得发酵汁，125℃灭菌15s，得到发明品—含gaba果蔬酵素产品1。

实施例2

首先按质量比选取1份新鲜刺梨、2份芦笋和2份山楂，清洗、消毒，去籽、破碎，转移至发酵罐中匀浆，加入1份蜂蜜后静置密封，进行群种自然发酵，控制发酵温度为30℃，发酵时间为40d，得第一发酵液。其次，按8%（v/v）接种耐乙醇片球菌cgmccno.13929种子液，进行纯种初期发酵，发酵30h后，加入谷氨酸钠终浓度为1g/l，进行纯种后期发酵，发酵温度为37℃，搅拌速度为100r/min，当发酵液中gaba含量达到500mg/l时，获得第二发酵液。然后固液分离得发酵汁，125℃灭菌15s，得到发明品—含gaba果蔬酵素产品2。

以上结合具体实施方式对本发明进行了说明，这些具体实施方式仅仅是示例性的，不能以此限定本发明的保护范围，本领域技术人员在不脱离本发明实质的前提下可以进行各种修改、变化或替换。因此，依照本发明所作的各种等同变化，仍属于本发明所涵盖范围。