厚味肽、浓厚味赋予剂、调味料及其制备方法与流程

本发明涉及具有呈味效果的肽及其制备方法，具体涉及具有厚味的γ-谷氨酰肽及其制备方法。
背景技术：
：γ-谷氨酰肽广泛存与多种动植物和发酵食品中，是一种安全天然、安全的食品成分。常见的谷胱甘肽其一级结构是γ-glu-cys-gly，是一种典型的γ-谷氨酰肽。现代研究表明γ-谷氨酰肽与生物体的代谢活动和生理功能有关，此外大部分γ-谷氨酰肽具有镇定减压、舒缓疲劳、抗癌解毒、络合重金属离子、维持细胞金属离子平衡等生理功能。近年来，人们发现γ-谷氨酰肽还具有较强的呈味特性。2002年日本味之素株式会社公开了通过探索具有casr激动剂活性的多种多样的化合物，发现具有更优异的浓味赋予作用，特别是具有前味型的浓味赋予作用，且具有优异的稳定性，可以简便而低成本地生产的能够赋予浓味的物质，提供包含该物质的浓味赋予剂，以及将该物质与其他具有casr激动剂活性的物质组合使用而成的复合浓味赋予剂。包含γ-glu-abu(l-γ-谷氨酰-l-2-氨基丁酸)的浓味赋予剂，以及该物质与其他具有casr激动剂活性的物质组合使用而成的复合浓味赋予剂(专利申请号201080024054.1)。在低浓度条件下的大部分γ-谷氨酰肽具有轻微涩味，随着浓度的提高，γ-谷氨酰肽开始呈现基本味道。例如γ-glu-glu在浓度为10mmol/l时有鲜味，γ-glu-tyr的苦味阈值是其涩味阈值的两倍。在鲜味溶液中，γ-谷氨酰肽具有厚味，阈值也在明显下降。随着人们对呈味肽的进一步了解，学者发现γ-谷氨酰肽具有厚味物质的特征：1.在水溶液中基本没有味道或只有轻微的味道(涩味或酸味)；2.能够与体系中的其他呈味物质发生协同增效作用，添加到含有鲜味物质的溶液体系中，不会改变溶液的基本味觉强度，但是能协调各种味道，显著增加浓厚感(kokumi)；3.与纯水溶液相比，在鲜味溶液中阈值明显下降。表1已报道γ-谷氨酰肽呈味特性和阈值一览表迄今为止，尚未见γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val具有浓厚味的报道。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种利用谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽的制备方法。本发明的目的通过以下技术方案实现。一种厚味肽，其氨基酸序列为γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val。一种浓厚味赋予剂，其由所述寡肽和如下一种以上的肽组合而成：γ-glu-x-gly(x表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-glu-val-y(y表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-glu-abu、γ-glu-ala、γ-glu-gly、γ-glu-cys、γ-glu-met、γ-glu-thr、γ-glu-val、γ-glu-orn、asp-gly、cys-gly、cys-met、glu-cys、gly-cys、leu-asp、d-cys、γ-glu-met(o)、γ-glu-γ-glu-val、γ-glu-val-nh2、γ-glu-val-ol、γ-glu-ser、γ-glu-tau、γ-glu-cys(s-me)(o)、γ-glu-leu、γ-glu-ile、γ-glu-t-leu和γ-glu-cys(s-me)。一种含有所述寡肽的调味料，其含有500重量mg/kg以上的γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val。一种含有所述寡肽的调味料，其含有1500重量mg/kg以上的γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val。所述的调味料的应用，具体是：在食品原料添加所述调味料外，还添加谷氨酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸和琥珀酸中的至少一种有机酸或其盐添加至食品原料而使其在食品中的浓度为0.005～0.1重量％。制备所述一种厚味肽的方法，具体是，谷氨酰胺与游离缬氨酸，摩尔比为1-2:1，溶于水中得溶液，调节反应ph为8.0-10.0，添加谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶为溶液质量0.02-1％(w/w)，在25-50℃反应3-12小时，后用4mol/l盐酸回调ph至6～7之间，90℃灭酶10min，得到含寡肽γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val反应液。以xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流动相a液为0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流动相b液为0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1ml/min，反应液的进样量10μl，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱，第7个峰即为寡肽γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val。进一步地，溶液中谷氨酰胺和游离缬氨酸的浓度在400-1000mmol/l。本发明与现有技术相比，具有如下优点：1)本发明首次公开了γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val具有厚味特性。2)首次公开了利用谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶催化制备γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val。附图说明图1为缬氨酸与谷氨酰胺混合物添加酶否呈味特性的差异图；图2为反应后混合物的液相色谱图；图3γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-gluval的二级质谱图；图4为γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val的呈味特性分析图；图5a～图5b分别为混合体系对牛肉汤和骨头汤的呈味改善效果对比图。具体实施方式以下结合附图和实例对本发明的具体是实施作进一步举例，但本发明的实施和保护不限于此。实施例1将300mm谷氨酰胺与300mm缬氨酸溶于100g水中，调节溶液的ph值至10.0，加入0.4g谷氨酰胺酶(日本天野株式会社，活力为100gtu/g)，在37℃分别反应12h，后用4mol/l盐酸回调ph至7.0后，90℃灭酶10min，对产物呈味特性进行感官评价，其反应前后呈味特性如图1。由图1可见，反应结束后，反应液的厚味、鲜味和咸味都显著提高了。hplc液相对反应产物进行定量分析：分析柱：xselecthsst35μm4.6x250mm；流动相：a液：0.1％(v/v)甲酸-水溶液；b液：0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液；柱温：40℃，流速：1ml/min。进样量10μl。其液相色谱图见图4。流动相进行梯度变化如表2所示。表2time/min05101520a/％9085209090图2中,出峰时间为5.619对应的峰7为γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val，对峰7进行收集，冷冻干燥得到γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val，并进行感官评价。uplc-ms/ms对反应产物进行定性分析：包括：anagilent1290seriesuplcsystem(agilenttechnologies)用于分离各γ-glu-peptides,带有anelec-trosprayionization(esi)的质谱系统(q-tofms/ms，brukerdaltonics)进行定性分析。色谱柱为：agilentzorbaxrrhdsb-c18(2.1x50mm,1.8μm)。进样量为5μl。液相条件为：溶液a为0.1％甲酸-水溶液，和溶液b为0.1％甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱程序为：0–10％b,0-5.0min；10-15％b,5.0-10.0min；然后100％b,10.0-12.0min。ms条件：ionization(离子化)：正离子模式；dryinggas(干燥气体)：350℃下10l/min；nebulizer(喷雾器压力)：25psig；fragmentor(毛细管电压)：30v。采用uplc-ms/ms对峰7，其检测结果如图3。由图3可知，其一级结构为γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val。称取0.01gγ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val，以及0.5g食盐和0.3g味精，溶解于100g水中，并和空白样(0.5g食盐和0.3g味精溶于100g水中)进行感官评价。感官评价实验由30-41岁有感官评价经验的7位男性和9位女性组成，感官评价结果见图4。由图4可见，添加0.01gγ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val的样品与对照相比，溶液的鲜味和咸味明显提高。实施例2将鸡胸肉和牛肉，分别放入15倍重量清水中，煮沸后保温25min，冷冻祛除汤面油脂，过滤得鸡汤和牛肉汤。加入汤质量0.5％(％为占汤质量计，下同)的食盐,添加0.01％γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val于鸡汤和牛肉汤中，评价其呈味特性变化。感官评价实验由30-41岁有感官评价经验的7位男性和9位女性组成，感官评价结果如图5a-图5b。由图5a-5b可见，添加0.01％γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val的鸡汤和牛肉汤，其鲜味和厚味均具有明显提高。由表3可见，γ-γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val和乳酸有较强的呈味相互作用，添加味精和乳酸可明显降低这γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val的刺激呈味阈值。表3(％为占水的质量百分比)a:酸味(mg/l),b:厚味.溶液ph值调到6.5实施例3将解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)swjs22(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.8425)以1％的接种量接种于发酵培养基(发酵培养基的组成为：4％豆粕、2％麸皮、2％玉米粉)中，37～39℃发酵培养30h。将发酵液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min，过滤得上清液，即谷氨酰胺酶粗酶液。将600mm谷氨酰胺和300mm缬氨酸溶于100g水中，分别调节溶液的ph值至9.0，加入1g粗酶液，在40℃分别反应12h后，用4mol/l盐酸回调ph至7.0后，90℃灭酶10min，得到γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val的反应液。采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流动相a液为0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流动相b液为0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1ml/min，反应液的进样量10μl，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱，第7个峰即为寡肽γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val。实施例4将枯草芽胞杆菌atcc6633以1％的接种量接种于发酵培养基(发酵培养基的组成为：4％豆粕、2％麸皮、2％玉米粉)中，37～39℃发酵培养48h。将发酵液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min，过滤得上清液，即γ-谷氨酰胺转肽酶粗酶液。将600mm谷氨酰胺和400mm缬氨酸溶于100g水中，分别调节溶液的ph值至8.0，加入1gγ-谷氨酰胺转肽酶粗酶液，在40℃分别反应6h后，用4mol/l盐酸回调ph至7.0后，90℃灭酶10min，得到含有γ-glu-γ-glu-γ-glu-val的反应液。采用xselecthsst35μm4.6x250mm分析柱，流动相a液为0.1％(v/v)甲酸-水溶液；流动相b液为0.1％(v/v)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1ml/min，反应液的进样量10μl，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱，第7个峰即为寡肽γ-glu-γ-glu-γ-glu-γ-glu-val。当前第1页12