7位，全长 234bp。设计引物人工合成（委托生物公司），用于后续实验。
[0033] 表1用于特异性扩增线粒体DNA巢式PCR引物信息
[0034]
[0036] 3.特异性条带PCR扩增
[0037] (1)将样本DNA、10XPCR缓冲液、dNTP(A、T、C、G四种脱氣核糖核苷三磷酸混合 液）、Mg2+溶液、上述引物及Taq酶、三蒸水按一定比例混合，进行PCR扩增，扩增后长度为 898bp，具体条件及反应体系如图1、表2所示。
[0038] 表2线粒体引物6F、6R特异性引物PCR体系
[0039]
[0040] ⑵以纯化产物为模板，采用文献报道的线粒体小引物Mt-Hp-F、Mt-Hp-R作为巢 式PCR的第二对引物，特异性扩增mtDNA4344-4577位，全长234bp。具体条件及反应体系 如图1、表2所示。
[0041] 表3粒体小引物Mt-Hp-F、Mt-Hp-R特异性引物PCR体系
[0042]
[0043] 利用6F和6R、Mt-Hp-F和Mt-Hp-R两对引物，特异性巢式PCR扩增保证了扩增片 段无核基因污染，并保证扩增效率。然后直接利用扩增的特异的目的片段进行酶切，省去了 琼脂糖凝胶回收目的片段繁琐复杂的操作步骤。
[0044] 4.专一件限制件内切酶Blaf和Nlalll酶切
[0045] 限制性内切酶Blaf识别序列为CTAG回文结构，线粒体DNA4401位置发生A>G 突变可被该酶识别，野生型线粒体DNA4545位也存在该识别位点，因此仅携带4401A>G 突变样本会被酶切割成168bp、55bp和llbp三段，但电泳两小时后llbp片段检测不到，并 不影响结果分析，从而电泳图上只显示168bp和55bp两条带（如图2A所示）；同理，限制性 内切酶Nlalll识别序列为CATG回文结构，线粒体DNA4435位置发生A>G突变可被该酶 识别，因此仅携带线粒体DNA4435A>G突变样本的酶切产物电泳图会显示131bp和93bp 两条带（如图2B所示）；双突变样本的酶切产物电泳图则会产生131bp、55bp和37bp三条 带（如图2D所示）；野生型样本则仍为单条带（如图2C所示）。将上述基因组提取试剂、 PCR扩增反应试剂；酶切反应试剂，包括限制性内切酶Blaf和Nlalll和酶切缓冲液；阳性 标准品、阴性标准品；使用说明书组合，组成用于体外检测线粒体DNA4401A>G和4435A >G突变试剂盒，将样本DNA提取、PCR扩增、限制性内切酶酶切在试剂盒基础上一次性完 成。讲上述特异性PCR产物ΙμL、限制性内切酶Blaf和Nlalll各0.5μ1及2ul10X酶 切缓冲液及三蒸水组成20ul体系，37°C恒温2h，进行酶切反应，然后85°C30min将酶热失 活以终止酶切反应，即可完成酶切。
[0046] 5.琼脂糖凝胶电泳鉴定
[0047] 讲上述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，取0. 75g琼脂糖，微波炉加热溶于 50ml1XTAEBuffer中，冷却至 60°C后加入 0.5μg/mlEB(Ethidiumbromide，溴化乙徒） 染料2. 5ul;混合均匀后导入胶槽，冷却后即为1. 5%琼脂糖凝胶，根据不同大小DNA分子在 胶中迀移率不同，即可对突变样本和正常样本的酶切产物进行鉴定。
[0048] 结果
[0049] 根据图2可知，因此仅携带4401A>G突变样本会被酶切割成168bp和55bp两条 带（如图2A所示）；仅携带线粒体DNA4435A>G突变样本的酶切产物电泳图会显示131bp 和93bp两条带（如图2B所示）；双突变样本的酶切产物电泳图则会产生131bp、55bp和 37bp三条带（如图2D所示）；野生型样本则仍为单条带（如图2C所示）。
[0050] 可靠性的检验
[0051] 将携带线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变样本和对照样本进行直接测序分 析，结果与本发明方法完全吻合。结果如图3所示。
[0052] 用本发明的方法及其制备的体外检测原发性高血压相关的线粒体DNA4401A>G 和4435A>G突变试剂盒具有以下特点：
[0053] 1.本发明的所用标本血液、尿液、组织等采集后仍可用于后续实验研究，如血液样 本可建立永生化类淋巴母细胞系、尿液细胞可用于成纤维细胞培养、组织可用于诱导多功 能干细胞的建立，可保存珍贵的遗传资源。
[0054] 2.目前已有的点突变检测方法，例如PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP)变 性高效液相色谱（DHPLC)和基因芯片等检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高， 适合高通量检测，但涉及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。因此，迫切需要一种快 速、准确、操作简易的突变筛查方法应用与临床突变筛查。
[0055] 但由于其自身的缺陷，如费时费力、操作繁琐以及检测费用偏高而不易在临床进 行推广。与这些方法相比较，本试剂盒借助特异性PCR技术与专一性限制性内切酶，利用双 酶切技术可直接根据酶切产物DNA片段数量及大小同时检测线粒体DNA是否发生4401A> G或4435A>G突变。另外值得一提的是，本试剂盒提供的阳性标准品和阴性标准品可以对 应用本试剂盒的检测结果进行对比分析，从而更直观、更清晰的分析检测结果。
[0056] 3.利用双酶切技术可直接根据酶切产物DNA片段数量及大小同时检测线粒体DNA 是否发生4401A>G或4435A>G突变。且酶切活性稳定，技术易掌握，且结果便于分析， 检测方便快速，必将成为临床推广原发性高血压线粒体相关突变的新方法。
[0057] 4.本发明提供的线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变检测试剂盒，提供了完 整的监测体系及详细的说明书，与其他检测方法相比，本发明检测方法操作简便、易掌握； 对仪器设备及操作人员无特殊要求，适合在一般医院、分子生物实验室开展，为全国性开展 原发性高血压相关的线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变的大规模筛查和预防性检查 提供条件，有效减少原发性高血压发生率，做到早筛查、早预防和早治疗。
[0058] 一种用于同时检测线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变的方法的试剂盒，包 括（1)提取样本全基因组DNA的试剂，包括包含裂解液、溶液I、酚-氯仿-异戊醇混合液和 溶液II;
[0059] (2)PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、引物、Taq酶和三蒸水；
[0060] (3)酶切反应试剂，包括限制性内切酶Blaf和Nlalll和酶切缓冲液；
[0061] (4)阳性标准品、阴性标准品；
[0062] (5)使用说明书。
[0063] 所述溶液I的主要成分为蛋白酶K，溶液II的主要成分为氢氧化钠。
【主权项】
1. 一种用于同时检测线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变的方法，其特征在于，所 述的方法包括以下步骤： (1) 提取全基因组DNA:运用蛋白酶K消化裂解蛋白质，酚-氯仿-异戊醇法，提取全基 因组DNA; (2) 特异性PCR扩增：根据人类线粒体基因剑桥参考序列，线粒体引物6F、6R作为巢式 PCR的第一对引物，特异性扩增mtDNA3796-4654位，全长898bp，产物进行纯化后，接着以 纯化后产物为模板，采用线粒体小引物Mt-Hp-F、Mt-Hp-R作为巢式PCR的第二对引物，特异 性扩增mtDNA4344-4577 位，全长 234bp; (3) 采用限制性内切酶Blaf的特异性识别序列为CTAG回文结构，限制性内切酶 Nlalll的特异性识别序列为CATG回文结构的特点，然后根据上述的特异性条带对扩增的 DNA进行酶切； (4) 电泳鉴定：酶切后产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据酶切产物DNA片段数量及大小即 可鉴定线粒体DNA是否发生4401A>G或4435A>G突变。2. 根据权利要求1所述的一种用于同时检测线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变 的方法，其特征在于：所述的全基因组DNA从细胞、血液以及组织样本中提取。3. -种权利要求1所述的用于同时检测线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变的方 法的试剂盒：其特征在于：所述的试剂盒包括提取样本全基因组DNA的试剂、PCR扩增反应 试剂、酶切反应试剂、阳性标准品、阴性标准品。4. 根据权利要求3所述的用于同时检测线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变的 方法的试剂盒，其特征在于：所述的取样本全基因组DNA的试剂包括包含裂解液、溶液I、 酚-氯仿-异戊醇混合液和溶液II，所述溶液I的主要成分为蛋白酶K，溶液II的主要成 分为氢氧化钠。5. 根据权利要求3所述的用于同时检测线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变的 方法的试剂盒，其特征在于：所述的PCR扩增反应试剂包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、弓丨 物、Taq酶和三蒸水。6. 根据权利要求3所述的用于同时检测线粒体DNA4401A>G和4435A>G突变的方 法的试剂盒，其特征在于：所述的酶切反应试剂包括限制性内切酶Blaf和Nlalll和酶切缓 冲液。
【专利摘要】一种用于同时检测线粒体DNA？4401A＞G和4435A＞G突变的试剂盒及其检测方法，所述方法包括DNA的提取、特异性引物设计、特异性条带PCR扩增、两种限制性内切酶Blaf和NlaIII酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定，本发明实现了10小时内出结果，且一种酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列，结果准确，本发明还提供检测线粒体DNA？4435A＞G和4401A＞G突变检测试剂盒，检测所需仪器要求低、所需试剂成本小、所需操作简单易掌握、所用方法稳定，特异性好等优点，适合大范围推广。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105274240
【申请号】CN201510808820
【发明人】薛凌, 唐霄雯, 于涵
【申请人】温州迈拓生物科技有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月20日