他克莫司代谢型的诊断标志物及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学及核苷酸检测
技术领域：
，具体地说，是他克莫司代谢型的诊断标志物及其应用。
背景技术：
：近年来，由于现代肝移植外科技术、免疫抑制剂以及供肝获取保存技术的革新，肝移植已取得了长足的进步，已成为治疗终末期肝病的标准方法，明显改善了患者的生活质量。钙调蛋白磷酸酶抑制药(CNIs)：环孢素A(CsA)、他克莫司(Tac)是目前肝移植术后抗排斥治疗的基础免疫抑制药。他克莫司(Tac)是一种具有大环内酯结构的强效免疫抑制剂，1982年由日本藤泽制药开始从发酵产物中研发，1984年从土壤真菌的肉汤培养基中提取出他克莫司的有效成分并研制出的新型免疫抑制药物，其分子结构是在23元环中嵌入有α、β二酮酰胺外罩的半缩醛的一大环内酯，实验室命名为FK506，商品名为他克莫司(Tacrolimus)，1993年4月确定了他克莫司在“抑制肝脏移植排斥反应”方面的作用和疗效，同年6月投放到国际市场应用于器官移植术后的免疫抑制治疗。他克莫司的免疫抑制作用机制主要是通过结合T淋巴细胞胞衆中的免疫啡啉，又称他克莫司结合蛋白12(FKBP12)的特异性受体，形成具有生物活性的Tac-FKBP12复合物，该复合物通过与钙调磷酸酶结合，并抑制钙调磷酸酶的活化，另外抑制NF-AT亚基的功能性聚合从而抑制其转录活性，在分子水平上干扰、抑制白细胞介素-2(IL-2)的合成，减少具有细胞毒性的T淋巴细胞向移植靶器官浸润，从而达到预防和治疗器官移植术后免疫排斥反应的目的。由于他克莫司对肝脏毒副作用小，逐步成为应用最为广泛的一种器官移植术后的免疫抑制剂，特别应用于肝移植术后的抗排斥反应。然而他克莫司属于严格剂量药物(criticaldosedrugs，CDD)。目前临床上他克莫司的用药剂量是根据患者体重决定，通过监测患者的他克莫司血药谷浓度来调整其使用剂量，使他克莫司的血药谷浓度控制在治疗血药浓度内。由于他克莫司的吸收分布存在明显的个体间和个体内的差异，治疗指数较低，安全范围较窄，尽管根据血药谷浓度及临床表现调整剂量，控制血药谷浓度在治疗窗内，仍难以避免器官移植术后急慢性排斥、他克莫司中毒的情况发生，甚至导致移植器官早期失去功能的严重后果，并且在临床上经常遇到相同体重、使用相同剂量的不同肝移植受体他克莫司的血药谷浓度却相差很大。长期以来，在日常临床工作中，很难制定出对所有肝移植患者都适用的他克莫司固定剂量，过量或不足均会带来严重的不良后果。技术实现要素：本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于检测他克莫司代谢型的诊断试剂盒。本发明的第二个目的是，提供CYP3A4rs2242480基因型、CYP3A5rs776746基因型及总胆红素水平三者联合作为他克莫司代谢型诊断标志物中的应用。为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种用于检测他克莫司代谢型的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包括检测基因CYP3A4rs2242480SNP位点的试剂，检测基因CYP3A5rs776746SNP位点的试剂，检测总胆红素含量的试剂。进一步，所述检测基因CYP3A4rs2242480SNP位点的试剂为包括检测基因CYP3A4rs2242480SNP位点的引物，所述检测基因CYP3A5rs776746SNP位点的试剂包括检测基因CYP3A5rs776746SNP位点的引物。进一步，所述引物碱基序列如下所示：针对CYP3A5rs776746位点：上游5’-TCTCCCCTCAAGTCCTCAG-3’，下游5’-CCATACCCCTAGTTGTACGAC-3’；针对CYP3A4rs2242480位点：上游5’-CACCCTGATGTCCAGCAGAAACT-3’下游5’-AATAGAAAGCAGATGAACCAGAGCC-3’。进一步，所述检测为检测肝移植手术供体CYP3A5rs776746基因型和检测肝移植手术受体CYP3A4rs2242480基因型。进一步，所述基因型的检测样本为肝组织。进一步，所述诊断试剂盒用于检测肝移植患者术后他克莫司代谢型。进一步，所述诊断试剂盒还包括说明书，所述说明书记载如下公式：P＝1/[1+e-(3.785-0.007X1-0.958X2-1.297X3)].其中X1表示：TBL血液浓度X2表示：CYP3A5rs776746(基因型AA或AG＝1,基因型GG＝2)X3表示：CYP3A4rs2242480(基因型AA或AG＝1,基因型GG＝2)如果检测P值大于0.6470时，即属于他克莫司快代谢型。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：CYP3A4rs2242480基因型、CYP3A5rs776746基因型及总胆红素水平三者联合作为他克莫司代谢型诊断标志物中的应用。本发明优点在于：1、目前临床上他克莫司的用药剂量是根据患者体重决定，然而不同基因型患者要达到相同的目标血药浓度，需要不同剂量的他克莫司治疗。本发明通过测定170对肝移植供、受体CYP3A5rs776746和CYP3A4rs2242480位点的单核苷酸多态性(SNP)和临床生化指标，探讨其对他克莫司代谢的关系，为临床肝移植患者个体化给药提供依据。2、本发明通过检测供体CYP3A5rs776746基因型、受体CYP3A4rs2242480基因型及患者总胆红素水平三者联合作为肝移植术后患者他克莫司代谢型的诊断指标，具有准确性高的优点。3、本发明基因型检测的筛选是通过严格的统计学计算出来的，择优选择，本发明供体CYP3A5rs776746基因型及受体CYP3A4rs2242480基因型的组合，是通过实验筛选的，相比于其它组合，例如受体CYP3A5rs776746基因型及供体CYP3A4rs2242480基因型，本发明的三联标志物用于他克莫司代谢型的检测具有准确性高的优点。附图说明附图1为模型供体CYP3A5基因型和受体CYP3A4基因型和总胆红素(TBL)与模型供体CYP3A5基因型预测他克莫司体重标化的剂量的比较(ROC曲线)。其中，D/W,体重标化的他克莫司剂量；AUC,曲线下面积；*,p<0.05；**,p<0.01。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1.一般资料收集2007年7月至2012年3月在上海市第一人民医院接受肝移植手术的患者170例。其中男141例，女29例。年龄(46.8±9.0)岁。体质量(68.0±11.5)kg。收集170对供、受体肝组织，置于-80℃低温冰箱保存备用，所有患者术后均采用他克莫司(FK506)+霉酚酸酯(MMF)+糖皮质激素免疫治疗方案。FK506自术后第2天开始用药，起始剂量为0.05-0.10mg/(kg·d)，每日剂量平均分为早晚两次服用，并监测药物谷浓度，根据血药浓度结果逐步调整用药剂量，使术后1个月的血药浓度维持在7-10ng/L。2.FK506全血谷浓度测定患者服用FK506后第2天晨起空腹抽取静脉血1ml，置于15％乙二胺四乙酸(EDTA)管中抗凝，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Pro-tracII试剂盒，Diasorin公司)检测FK506的全血浓度并进行校正。以血药浓度除以每日每公斤体质量的FKS06剂量，得到浓度/剂量比值(C/D值)，即全血谷浓度与每日每公斤体质量用药剂量的比值。以肝移植术后1个月内每周的C/D值中位数作为反映他克莫司代谢表型的参数。3.DNA测序分析基于多态性供、受体分别取20～50mg解冻肝组织，应用AllPrepDNA/RNAMini(Qiagen，Hilden，德国)试剂盒进行基因组DNA提取。应用2720Thermalcycler聚合酶链反应(PCR)仪(AppliedBiosystems公司)进行PCR扩增，引物序列分别为：CYP3A5rs776746：上游引物为5’-TCTCCCCTCAAGTCCTCAG-3’，下游引物为5’-CCATACCCCTAGTTGTACGAC-3’；CYP3A4rs2242480：上游引物为5’-CACCCTGATGTCCAGCAGAAACT-3’，下游引物为5’-AATAGAAAGCAGATGAACCAGAGCC-3’。取PCR产物5μl进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，并以DNAMarker作对照后回收含有目的DNA的凝胶。将凝胶逐步处理洗脱后的DNA，采用ABI公司3730-XL型钡4序仪(AppliedBiosystems公司)进行测序，证实PCR的扩增产物为以上目的基因，并直接判断基因的SNP。4.统计学方法应用SHEsis软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)计算基因型和等位基因频率，并进行Hardy-Weinberg平衡及连锁不平衡检测。应用SPSS19.0统计软件分析，计数资料用平均数+SE表示，数据比较采用t检验，卡方检验和非参数检验方法。两组之间的比较采用Mann.Whitney检验，多组之间的比较采用Kruskal.Wallis检验。采用二元logistic回归和ROC曲线求得诊断点5.结果5.1快代谢基因A的数目(联合供体CYP3A5和受体CYP3A4)和总胆红素(TBL)预测他克莫司代谢在100例上海市第一人民医院肝移植患者实验组(表一)和70例上海市第一人民医院肝移植患者验证组中(表二)，发现快代谢A基因的数目(联合供体CYP3A5和受体CYP3A4)和总胆红素分别与他克莫司的计量(D)，他克莫司浓度(C)和浓度/剂量比值(C/D)有统计学意义(P<0.001)。将A基因数目分为两组，A基因数目≥2和A基因数目＜2，两组的C/D值在第一周，第二周，第三周和一个月有统计学意义，分别为<0.001；0.001；<0.001和<0.001，在第四周的时候接近有统计学意义，P值为0.085(表三)。表一多元线性回归分析(实验组)表二多元线性回归分析(验证组)表三供体CYP3A5rs776746与受体CYP3A4rs2242480位点基因多态性联合分析注：≤1,GGGG,GGGA；≥2,GGAA,GAAA,AAAA5.2供体CYP3A5基因型和受体CYP3A4基因型和总胆红素(TBL)预测他克莫司体重标化的剂量：ROC曲线在图1中模型供体CYP3A5基因型和受体CYP3A4基因型和总胆红素(TBL)预测体重标化的他克莫司日常需要量在第一周，第二周，第三周，第四周，一个月(图1A-E)的曲线下面积分别为0.722，0.712，0.704，0.610，和0.711，均优于单单的模型供体CYP3A5基因型，相应的曲线下面积为0.607，0.594，0.582，0.561和0.603，均有统计学意义，P值分别为0.001，0.001，0.001，0.017和0.001。取假阳性率R＝10％，求得诊断点为0.6470(表四)，当P≥0.6470，病人属于快代谢型。表四变量PRE_2的曲线坐标点注：PRE_2＝供体CYP3A5基因型，受体CYP3A4基因型和总胆红素5.3个体的预测表五协变量X1，X2和X3的Logistic回归系数、标准误和P值协变量回归系数标准误P值X1-0.0070.0040.064X2-0.9580.3490.006X3-1.2970.350<0.001常数3.7850.835<0.001根据公式P＝1/[1+e-(3.785-0.007X1-0.958X2-1.297X3)].其中X1表示：TBL血液浓度X2表示：CYP3A5rs776746(基因型AA或AG＝1,基因型GG＝2)X3表示：CYP3A4rs2242480(基因型AA或AG＝1,基因型GG＝2)如果有1个病人测得的数据代入上述方程中，测得P值大于0.6470时，该病人属于他克莫司快代谢型。表六供、受体CYP3A5和CYP3A4基因型在不同时间段对他克莫司代谢的影响以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3