一种香蕉黑星病菌分子检测引物及检测方法与流程

本发明涉及一种香蕉黑星病菌分子检测引物及其检测方法，专用于香蕉黑星病菌的快速分子检测，同时可实现田间香蕉黑星病菌的早期诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害检测和生物技术领域。

背景技术：

香蕉是世界上产量最大的水果作物，也是世界著名的热带、亚热带水果，。也是中国热带亚热带的主要水果，香蕉其具有独特的品味和较高的营养价值，历来堪称一种上乘的保健果品。中国是世界香蕉主产国之一，具有悠久的栽培历史，也是世界的香蕉种植生产大国之一，香蕉的栽培面积和产量居全国水果的第四位。

香蕉黑星病又称黑痣病、雀斑病，可为害香蕉叶片、果柄和果实，在我国各香蕉种植区普遍存在。发病时叶片及中脉产生许多散生或群生的突起小黑斑，直径约l mm，其周缘淡褐色，中部稍下陷，上着生小黑粒。病斑密集成块斑，最后导致叶片枯黄，果实发病，症状常在断蕾后2～4周出现，多在果指弯腹部分，严重时全果均有，初期为红棕色、外围暗绿色水晕，随着果实肉度增大，病斑密度增大，严重的扩展至全果，影响果实的外观和耐贮性，近年来香蕉黑星病在我国香蕉产区普遍发生且为害日益严重，已成为香蕉生产上的重要病害之一。

香蕉黑星病菌(Phyllosticta musarum)在PDA、PSA和V8等常见培养基上生长很缓慢，在进行分离时菌落常常被杂菌所覆盖，而且分生孢子器产生时间晚。难以在早期鉴别。到1972年还未获得纯培养，除此之外以症状为基础的病害常规诊断技术，需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析等步骤，耗时长、效率低、准确性差，难以做到病害发生时及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行，难以满足香蕉黑星病诊断的实际需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度高的快速诊断技术。

近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，其中PCR（polymerase chain reaction）技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断。真菌核糖体转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计特异性引物进行PCR，对病原菌进行快速检测和鉴定的技术已受到广泛的应用，国内外研究人员已成功开发出大豆疫霉、辣椒疫霉、柑橘溃疡病菌、甘薯黑斑病菌和玉米南方锈病菌等多种病原菌的特异性引物和检测方法，实现了快速、灵敏和准确的鉴定。但目前有关香蕉黑星病菌分子检测的研究尚未见报道。

技术实现要素：

针对现有技术中对香蕉黑星病菌的检测和鉴定主要基于病原形态学特征，香蕉黑星病菌生长缓慢，分离难度大，分离程序繁琐、耗死长、对鉴定经验要求高、准确度低，难以满足香蕉黑星病诊断的实际需要问题，提供了一种香蕉黑星病菌分子检测引物及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

本发明首先提供了一种香蕉黑星病菌分子检测引物，其核苷酸序列为：

上游引物BMF：5’-GCTACAACGCCGAAATGACC-3’；

下游引物BMR：5’-GACGTTGCCCAATACCAAGC-3’。

所述引物BMF和BMR对香蕉黑星病菌特异性扩增出382bp的产物。

本发明还提供了一种香蕉黑星病菌的快速检测方法，包括以下步骤：

(1)从香蕉叶片或果实中提取DNA；

用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA；用于检测香蕉组织是否存在香蕉黑星病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株组织基因组DNA；

(2) 以提取香蕉叶片或果实的DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出382bp的产物，则可判定所述的香蕉叶片或果实中存在香蕉黑星病菌，否则所述的香蕉叶片或果实中不存在香蕉黑星病菌。

本发明的积极有益效果在于：

（1）准确性高：本发明是根据真菌核糖体转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种内的高度保守性和科属种间可变性的特点设计对香蕉黑星病菌具有特异扩增作用的PCR 引物。已经对不同地理来源的香蕉黑星病菌、携带香蕉黑星病菌的植物叶片、携带香蕉黑星病菌的果皮和健康的香蕉组织进行了检测验证，只有香蕉黑星病菌和携带该病菌的香蕉组织能特异性地扩增出一条382 bp 的电泳条带，说明本发明所设计的引物用于检测香蕉黑星病菌准确可靠；

（2）特异性强：本发明所设计的引物对香蕉黑星病菌具有很强的特异性，能够用于区别香蕉黑星病菌、香蕉炭疽病、香蕉弯孢霉叶斑病菌、香蕉黑斑病菌、香蕉砖格孢叶斑病菌及香蕉暗双孢叶斑病菌等香蕉上常见的病原菌，从而能有效区分发生在香蕉上症状特征相似的病害；

（3）灵敏度高：本发明将设计的特异引物与ITS 基因通用引物（ITS1/ITS4）联合起来进行巢式PCR 扩增后，对香蕉黑星病菌的检测灵敏度在DNA 水平上可达到1fg；

（4）适用性广、实用性好：本发明的香蕉黑星病菌的检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的香蕉叶片和果皮进行检测，可实现香蕉黑星病菌的早期检测，即在病害显症前进行检测，对预防香蕉生长期和采摘后黑星病的爆发流行有重要意义。

（5）、操作简便快速：本发明只需进行DNA 提取、PCR 扩增和琼脂糖电泳后即可判定结果，一般整个检测过程可在数小时内完成，操作简便快捷。

附图说明

图1为本发明引物对香蕉黑星病菌特异性扩增电泳图：其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2、泳道3为香蕉黑星病菌，泳道4-11分别为：香蕉炭疽病菌、香蕉弯孢霉叶斑病菌、香蕉黑斑病菌、香蕉砖格孢叶斑病菌、香蕉暗双孢叶斑病菌、香蕉枯萎病菌、芦笋茎枯病菌、阴性对照。

图2为本发明引物香蕉黑星病菌的灵敏性检测扩增电泳图：A：普通PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2-11分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、阴性对照、阳性对照；B为巢式PCR灵敏度检测，其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2-13分别为：100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg、100ag、阴性对照、阳性对照。

图3为本发明香蕉叶片和香蕉果皮种黑星病菌检测扩增电泳图，其中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道2-10分别为自然发病的香蕉叶片、自然发病香蕉果实、人工接种发病的香蕉叶片、人工接种后发病初期香蕉果实、健康香蕉叶片、健康的香蕉果皮、健康的香蕉果柄、阴性对照、阳性对照。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 分子检测引物设计及香蕉黑星病菌特异分子检测方法的建立

1.香蕉黑星病菌基因组DNA的提取：

采用 CTAB 法提取本实验室保存的6株香蕉黑星病菌的基因组 DNA，具体步骤如下：

(1)取0.1 g菌丝粉于1.5 mL 离心管中，加入900μL2%CTAB提取液，使用振荡器振荡混匀，60℃水浴60min，室温条件下，12000r/min离心15 min；

(2)取上清液700μL，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液（各体积比为25:24:1），温和摇动，室温条件下，8000 r/min离心10min ；

(3)取上清液500μL，加入等体积氯仿再抽提一次，室温条件下，8000 r/min离心10min；

(4)取上清液350μL，加入1/10 体积3 mol/L NaAc 和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀60 min，4℃条件下，8000 r/min离心5 min ；

(5)弃去上清液，加入700μL 体积浓度为70%冰乙醇，轻摇10sec，4℃条件下，8000 r/min离心10sec，晾干，加入50μL TE缓冲液，-20℃保存备用。

2.香蕉黑星病菌ITS序列测定：

以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 为引物对提取香蕉黑星病菌的DNA 进行PCR 扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara 大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10min；所得PCR产物送大连宝生物工程有限公司测序，并提交GenBank，获得序列号为KX611161。

3.香蕉黑星病菌特异分子检测引物的设计：

根据香蕉黑星病菌核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列在真菌种间高度变异和种内稳定性，用Clustal X软件将测序得到的6 株香蕉黑星病菌的ITS 序列与GenBank 中Phyllosticta属不同种的ITS序列、香蕉炭疽病菌ITS 序列、香蕉弯孢霉叶斑病菌ITS 序列、香蕉黑斑病菌ITS 序列、香蕉砖格孢叶斑病菌ITS 序列、香蕉暗双孢叶斑病菌ITS 序列、香蕉枯萎病菌ITS 序列进行同源性分析和差异位点比较，用BMRimer BMRimer5软件设计了对香蕉黑星病菌具有特异性扩增作用的一对PCR引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，即特异分子检测引物的序列为：

上游引物BMF：5’-GCTACAACGCCGAAATGACC-3’；

下游引物BMR：5’-GACGTTGCCCAATACCAAGC-3’

4.香蕉黑星病菌快速分子检测方法的建立：

(1)从香蕉叶片或果实中提取DNA:

①用于检测病原菌纯培养物时，采用 CTAB 法提取供试菌株基因组 DNA;

②用于检测香蕉植株组织是否存在香蕉黑星病菌时，采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株组织基因组DNA，具体步骤如下：

a.称取待检测的植物组织0.1 g，加入0.5 mol/L NaOH 30μL，将组织充分磨碎成糊；

b.将糊状组织转入1.5 mL 离心管中，12000r/min 离心6 min，取上清液5μl；

c.上清液中加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0），混合均匀，取1.0μL 作为PCR 模板进行扩增；

(2) 以提取香蕉叶片或香蕉果实DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；

(3)上步所得的PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上用0.5×TBE缓冲液电泳分析，电压为4-5V/cm；根据扩增产物的大小判定检测结果，如果能特异性扩增出382bp的产物，则可判定所述的香蕉叶片或香蕉果实中存在香蕉黑星病菌，否则所述的香蕉叶片或香蕉果实中不存在香蕉黑星病菌。

实施例2 香蕉黑星病菌特异性扩增

1.采用CTAB 法提取2株香蕉黑星病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉弯孢霉叶斑病菌、香蕉黑斑病菌、香蕉砖格孢叶斑病菌、香蕉暗双孢叶斑病菌、香蕉枯萎病菌及芦笋茎枯病菌的基因组DNA。

2. 以提取供试菌的DNA为模板进行PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

3.特异性扩增结果

如图1所示，2株香蕉黑星病菌可以特异性扩增出382bp的条带，而香蕉炭疽病菌、香蕉弯孢霉叶斑病菌、香蕉黑斑病菌、香蕉砖格孢叶斑病菌、香蕉暗双孢叶斑病菌、香蕉枯萎病菌、芦笋茎枯病菌和阴性对照均无扩增条带，表明本发明的分子检测引物可以将香蕉黑星病菌与为害香蕉的其他病原菌区分开来，具有很强的特异性，本发明的检测方法可用于香蕉黑星病菌的特异性扩增。

实施例3本发明引物对香蕉黑星病菌的灵敏性检测

1.采用CTAB 法提取香蕉黑星病菌的基因组DNA；

2.将提取的香蕉黑星病菌的基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，用无菌超纯水稀释，配制成系列浓度，备用；

3. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

4. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行巢式PCR扩增：

（1）第一轮PCR 扩增：以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS） 通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3' 为外引物对配制的成系列浓度DNA 进行第一轮PCR 扩增，扩增反应体系和反应程序为：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶（Takara 大连宝生物工程有限公司），10μmol/L的TIS1和ITS4各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1 min，55℃退火45sec，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10min；

（2）第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增的产物为模板，以BMF/BMR为引物进行第二轮PCR扩增，PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共30个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

5.检测结果

如图2所示，以本发明引物BMF/BMR为引物进行常规PCR时，在25μL反应体系中，10pg的香蕉黑星病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到10pg（图2-A）；而进一步以真菌核糖体基因转录间隔区（rDNA-ITS）的通用引物TS1:5'-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3'和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 为外引物扩增的产物为模板，以本发明引物BMF/BMR为引物进行第二轮扩增时，在25μL反应体系中，1fg的香蕉黑星病菌DNA可以获得可视条带，其检测灵敏度可达到1fg(图2-B)。

实施例4香蕉叶片和果实中香蕉黑星病菌的检测

1.采用NaOH 快速裂解法提取香蕉植株组织基因组DNA。

2. 以配制的成系列浓度DNA为模板进行常规PCR扩增：PCR反应体系25μL，包含2.5μL 10×PCR buffer，2.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP Mixture，0.15μL浓度为5U/μL的Taq酶，10μmol/L的BMF和BMR各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH₂O至总体积达25μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45sec，56℃退火45sec，72℃延伸45sec，共35个循环；72℃延伸10min；电泳检测扩增产物。

3. 检测结果

如图3所示，自然发病的香蕉叶片、自然发病香蕉果实、人工接种发病的香蕉叶片、人工接种发病初期香蕉果实和阳性对照中均可产生382bp左右的可视条带，而健康香蕉叶片、健康的香蕉果皮、健康的香蕉果柄、阴性对照均无任何条带出现，表明本发明引物和检测方法还可用于田间香蕉植株中香蕉黑星病菌的检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种香蕉黑星病菌分子检测引物及检测方法

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