鸡源大肠埃希菌药敏试验方法
【专利摘要】本发明提供一种鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，涉及畜牧业，以解决现有药敏试验方法步骤繁琐耗时长的问题。一种鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，包括如下步骤：采集样本，从大肠埃希菌致死的鸡的实质脏器取样；接种培养，将采集的大肠埃希菌样本均匀涂布在MH培养基；药敏试验，将药敏纸片均匀贴在涂有大肠埃希菌的MH培养基表面，并置于35℃～42℃的环境中孵育，6小时后获得实验结果。本发明用以简化药敏试验方法步骤减少试验时间。
【专利说明】鸡源大肠埃希菌药敏试验方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及畜牧业，特别是指一种鸡源大肠埃希菌药敏试验方法。
【背景技术】
[0002]养鸡业是我国畜牧业发展的支柱产业之一，带动了亿万农民脱贫致富。由于养鸡业的集约化、规模化，造成饲养密度过大、鸡舍环境污染严重，导致鸡病发生逐年增多，其中败血型鸡源大肠埃希菌(条件性致病菌)病发生较为严重，约占鸡病临床病例的25%，致死率约占90%以上，易成为其他疾病的并发病或继发病，给养殖场(户)造成较为严重的经济损失。
[0003]药物防治是治疗本病的一项重要措施，但是，兽医临床对规模化、集约化畜禽饲养场大肠杆菌感染采用:一旦有几只或几头发病则全群投药防治的方法。随着抗菌药物的广泛和大剂量使用，鸡源大肠埃希菌的耐药性(多重耐药和泛耐药)逐年增加，(泛耐药菌株又称超级大肠杆菌)，用药成本也大大增加，这不仅给防控该病带来困难，而且禽产品的药物残留已给食品安全和国家出口贸易带来不良影响。用药敏试验对致病性大肠埃希菌进行耐药性检查，筛选出敏感性药物，确定合适的剂量和合理的疗程，是兽医临床的迫切需要。
[0004]国际没有禽用药敏标准，我国兽医临床通常参考“纸片法(K-B法)抗菌药敏试验标准”(WS/T125-1999)，采用“细菌分离-鉴定-药敏试验”三步法。标准纸片法药敏试验在进行最终判读时需要18h~24h (病原菌的分离培养)+12h~24h (纯化一代纯菌落的培养)+16h~24h(纯菌落的培养)+16h~24h(药敏试验),即最少62h~96h。标准药敏试验对试验条件要求较高、步骤较为繁琐，出具报告时间较长，往往会耽误疾病的最佳治疗期，不能满足临床的迫切需要。
[0005]农业部(农医发
[2011]5号)，药敏试验采用的是微量肉汤稀释法。这一方法操作复杂，耗时较纸片法(K-B法)抗菌药敏试验更长，适合科研工作，临床应用甚为不便，难以推广应用。
[0006]崔保安等在“应用快速药敏试验筛选治疗鸡大肠杆菌病的药物” [J].《中国畜禽传染病》1991年第2期报道“取部分肝组织，按1:5加生理盐水研磨制成悬液，静置5分钟，用悬液涂布营养琼脂平板，37°C培养13h~24h判定结果，标本直接药敏试验与分离菌株药敏试验结果一致，节约时间46h~72h。但是肝组织研磨易污染杂菌，药敏判读时间较长。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供一种鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，以解决现有药敏试验方法步骤繁琐耗时长的问题。
[0008]为解决上述技术问题，本发明实施例提供一种鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，包括如下步骤:
[0009]采集样本，从大肠埃希菌致死的鸡的实质脏器从采集大肠埃希菌样本；
[0010]接种培养，将采集的大肠埃希菌样本均匀涂布在MH培养基；
[0011]药敏试验，将药敏纸片均匀贴在涂有大肠埃希菌的MH培养基表面，并置于35°C~42°C的环境中孵育，6小时后获得实验结果。
[0012]其中，所述MH培养基由1.5g~2.0g牛肉粉、1.0g~2.0g可溶性淀粉和17.0g~18.0g酸水解酪蛋白加热溶解于100ml蒸馏水中，115°C~125°C高压灭菌制得。
[0013]其中，所述MH培养基的厚度为3.5mm~4.5mm。
[0014]其中，所述药敏纸片含有抗生素，所述药敏纸片的pH值为中性。
[0015]其中，所述药敏纸片采用新华I号定性试纸。
[0016]其中，所述药敏纸片呈圆形，所述药敏纸片的直径为5~7_
[0017]本发明的上述技术方案的有益效果如下:
[0018]上述方案中，直接药敏试验耗时少、费用低，养殖场(户)乐于接受，减少量药物浪费、畜产品残留、耐药菌株的产生、畜禽排泄物抗生素对环境的污染，同时也减少因食物链引起人体耐药菌株的产生，该发明惠及环境保护、动物及人体健康，有利于可持续发展。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明实施例的步骤流程示意图。
【具体实施方式】
[0020]为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
[0021]如图1所示，本发明实施例针对现有的药敏试验方法步骤繁琐耗时长的问题，提供一种鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，包括如下步骤:
[0022]采集样本，从大肠埃希菌致死的鸡的实质脏器上采集大肠埃希菌样本；
[0023]接种培养，将采集的大肠埃希菌样本均匀涂布在MH培养基(Mueller-HintonBroth，肉汤培养基)；
[0024]药敏试验，将药敏纸片均匀贴在涂有大肠埃希菌的MH培养基表面，并置于35°C~42°C的环境中孵育，6小时后获得实验结果。具体地，本发明鸡源大肠埃希菌药敏试验方法的实施步骤如下:
[0025]S1、由2g牛肉粉、1.5g可溶性淀粉和17.5g酸水解酪蛋白加热溶解于100ml蒸馏水中，121°C高压灭菌制得厚度为4mm的MH培养基。
[0026]S2、取新华I号定性滤纸,用打孔机打成6mm直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的抗生素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37 °C温箱或烘箱中，使完全干燥。
[0027]在上述含有50片纸片的抗生素瓶内加入硫酸妥布霉素0.25ml，并翻动纸片，使各纸片充分浸透硫酸妥布霉素，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37°C温箱内过夜，干燥后即密盖，置阴暗干燥处存放，此时药敏纸片的pH值为中性。
[0028]S3、采集样本，从大肠埃希菌致死的鸡的实质脏器上采集大肠埃希菌样本，实质脏器可以为心脏或、肝脏；大肠埃希菌可附着在肝脏、心脏表面形成生物被膜一肝周炎、心包炎，生物被膜含有巨大数量细菌，培养基表面接种较大数量细菌时可形成菌苔。
[0029]取材较人医临床方便，禽类直肠温度40°C~42°C，适宜大肠杆菌生长。大量大肠杆菌菌体附着在鸡体内脏器官及其表面形成的生物被膜，生物被膜富集菌体数量往往高于
0.5麦氏单位；在实际培养中，0.5麦氏比池度涂布MH培养基孵育一段时间后现形成单个菌落再融合成菌苔，而从肝周炎、心包炎取样直接涂布MH培养基孵育一段时间后直接形成菌苔。
[0030]S4、接种培养，用灭菌接种环取适量细菌分别在MH培养基边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至MH培养基的1/2。然后，找到第二点划线至MH培养基的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于MH培养基。
[0031]S5、药敏试验，将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏纸片贴到MH培养基表面。为了使药敏纸片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏纸片。为了使能准确的观察结果，要求药敏纸片能有规律的分布于MH培养基上；一般可在MH培养基中央贴一片,外周可等距离贴若干片(外周一般可贴七片)，置于38.5°C的环境中孵育。
[0032]大肠埃希菌属快速生长嗜温菌，生长温度范围10°C~45°C，最适生长温度20°C~400C。在适宜条件下分裂一次仅需20min，对数生长期持续6h~10h，该期的病原菌致病力最强，对抗菌药物的作用较为敏感。
[0033]S6、判读结构，在涂有大肠埃希菌的MH培养基上，抗菌药物在MH培养基内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的大肠埃希菌生长受到抑制。一段时间培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。
[0034]由于大肠埃希菌在6小时后进入对数生长期，此时的大肠埃希菌对抗菌药物的作用较为敏感，根据药物敏感实验判定标准表1可直接判读结果。
[0035]表1
[0036]
【权利要求】
1.一种鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，其特征在于，包括如下步骤: 采集样本，从大肠埃希菌致死的鸡的实质脏器上采集大肠埃希菌样本； 接种培养，将采集的大肠埃希菌样本均匀涂布在MH培养基； 药敏试验，将药敏纸片均匀贴在涂有大肠埃希菌的MH培养基表面，并置于35°C~42°C的环境中孵育，6小时后获得实验结果。
2.根据权利要求1所述的鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，其特征在于，所述实质脏器为心脏或肝脏。
3.根据权利要求1所述的鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，其特征在于，所述MH培养基由1.5g~2.0g牛肉粉、1.0g~2.0g可溶性淀粉和17.0g~18.0g酸水解酪蛋白加热溶解于100ml蒸馏水中，115°C~125°C高压灭菌制得。
4.根据权利要求3所述的鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，其特征在于，所述MH培养基的厚度为3.5mm~4.5mm。
5.根据权利要求1所述的鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，其特征在于，所述药敏纸片含有抗生素，所述药敏纸片的pH值为中性。
6.根据权利要求1所述的鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，其特征在于，所述药敏纸片采用新华I号定性试纸。
7.根据权利要求1所述的鸡源大肠埃希菌药敏试验方法，其特征在于，所述药敏纸片呈圆形，所述药敏纸片的直径为5~7mm。
【文档编号】C12Q1/18GK104073545SQ201410321598
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】李桂喜, 王珍珍 申请人:李桂喜