专利名称：大肠埃希菌中mdfA基因的检测引物及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种大肠埃希菌(Escherichia coli,EC0)中耐消毒剂mdfA基因携带情况的检测方法，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
细菌的外排泵系统可分5类ATP结合盒转运体家族(ATP-binding cassette family, ABC)、主要易化因子超家族(the major facilitator superfamily, MFS)、药物与代谢物转运体超家方矣(the much larger drug/metabolite transporter superfamily, DMT)及与之相关的小多药外排家族(the small multi drug resistance family, SMR)、多药物与毒物外排家族(the multi drug and toxic compound extrusion family, MATE)、 耐受-生节-分裂家族(the resistance-nodulation-division family, RND)。ABC 为能量泵，其余为质子泵。质子泵为细菌通过质子稱联交换产生的质子驱动力(proton motive force, PMF)介导的次级药物(化合物)转运系统。细菌通过此类基因表达对多种化合物 (含消毒剂、灭菌剂)的耐药。mdfA编码超广谱外排泵基因，能外排溴化乙锭、结晶紫、普鲁黄和罗丹明等多种抗菌染料。目前检测mdfA基因携带情况的方法主要有PCR后琼脂糖凝胶电泳、测序。凝胶电泳法成本低、易操作，但灵敏度低，容易出现假阴性；测序是检测基因突变的金标准，但测序技术步骤繁琐、耗时长、容易污染。
发明内容
本发明的目的是提供大肠埃希菌中耐消毒剂mdfA基因携带情况的PCR检测引物及使用该引物的检测方法。为了达到上述目的，本发明提供了一组大肠埃希菌中mdfA基因的检测引物，其特征在于，包括(A) · mdfA 基因正向引物5' -ttccctctctgtctggtgct-31 ；(B) · mdfA 基因反向引物5' -cccagcagccattgtaaaaa-3'。本发明还提供了一种大肠埃希菌中mdfA基因的检测方法，其特征在于，采用上述大肠埃希菌中mdfA基因的检测引物，具体步骤为第一步取经培养后鉴定为大肠埃希菌阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带mdfA基因的大肠埃希菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成mdfA序列，构建携带mdfA基因的重组质粒为阳性对照品；第二步用无菌水配制浓度为5-15umol/L的mdfA基因正向引物溶液，浓度为5-15umol/L的mdfA基因反向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的mdfA基因检测探针溶液；mdfA基因正向引物的序列为5 ' -tccctctctgtctggtgct-3 ' , mdfA基因反向引物的序列为5' -ccagcagccattgtaaaaa-3 ' , mdfA基因检测探针的序列为 FAM-tggcgggcgggatg-MGBNFQ ；
第三步在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的mdfA基因正向引物溶液O. I-Iul、mdfA基因反向引物溶液O. I-Iul、mdfA基因检测探针溶液O. Ι-lul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品O. Ι-lul，用灭菌重蒸馏水补足25ul ;在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40-60°C保温1-3分钟，80-10(TC保温1_3分钟，再运行30-50个循环，每个循环包括在 80-100。。保温 10-20 秒，再在 50-70°C保温 O. 5-1. 5 分钟；第四步用软件SDS2. 2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带mdfA基因。本发明是对大肠埃希菌中是否还有耐消毒剂mdfA基因的检测，细菌一旦获得此基因即可对现用的消毒剂耐受，使消毒剂失效，通过检测了解细菌中mdfA基因的携带情况，有利于对含有耐消毒剂基因的菌株的监控，防止菌株继续流行，同时从科研角度对其耐药机理的进一步了解还有利于新的灭菌制剂的研制开发。本发明基于实时荧光定量PCR技术，应用具有分辨率更高、杂交特异性更强、重现性好等特点的Taqman-MGB探针，不仅检测率高、可重复性强，检测速度快，全部反应在封闭的反应管中完成，有效避免了交叉污染，且自动化程度高，能够实时监控，提供质控标准品， 使结果判读更直观。
图I为携带mdfA基因的阳性对照品的Realtime PCR曲线图；图2为Realdme PCR阴性对照品的Realtime PCR曲线图；图3为携带mdfA基因检测样品的Realtime PCR曲线图；图4为mdfA基因检测样品的琼脂糖凝I父电泳图；图5为mdfA基因检测样品的测序图。
具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例I、采用固相亚磷酰胺三酯法制备一组用于检测大肠埃希菌中mdfA基因携带情况的引物，包括mdfA 基因正向引物5' -tccctctctgtctggtgct-31 ；mdfA 基因反向引物5' -cccagcagccattgtaaaaa-3'。2、一种大肠埃希菌中mdfA基因携带情况的检测方法，具体步骤为(I)取经培养后鉴定为大肠埃希菌阳性的临床样本分离株，高温灭活，用高品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒(深圳易瑞生物技术有限公司，YP03002)提取样本DNA，稀释至30ul(浓度lOng/ul)，置-20°C保存，待用；将标准大肠埃希菌株(保藏单位中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号ATCC:+ Kumber: 25922),高温灭活，用商品化的细菌基因组DNA磁珠提取试剂盒(深圳易瑞生物技术有限公司，YP03002)提取样本DNA，稀释至 30ul (浓度10ng/ul)，作为阴性对照品；人工合成mdfA序列(由上海生工合成)，构建携带 mdfA基因的重组质粒,稀释至30ul (浓度10ng/ul),为阳性对照品。(2)根据mdfA基因的保守区域，采用ABI Primer Express 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成引物及Taqman探针，探针序列一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料(由上海生工合成)，用无菌水配制浓度为lOumol/L的mdfA基因正向引物溶液，浓度为lOumol/L的mdfA基因反向引物溶液以及浓度为lOumol/L的mdfA基因检测探针溶液，其中，引物和检测探针序列如下mdfA 基因正向引物5' -tccctctctgtctggtgct-31 ；mdfA 基因反向引物5' -cccagcagccattgtaaaaa-3'；mdfA 基因检测探针FAM_tggcgggcgggatg-MGBNFQ。⑶在每一个PCR 反应孔中加入 PCR Master Mix (Applied Biosystems 公司生产的 Taqman Universal PCR Master Mix 2X，包括 10 XPCR 缓冲液、MgC12、dNTP、DNA 聚合酶)12. 5ul，mdfA基因正向引物溶液0. 5ul，mdfA基因反向引物溶液0. 5ul，mdfA基因检测探针溶液0. 5ul。然后在不同的PCR反应孔中分别加入步骤(I)得到的检测样品、阴性对照品或阳性对照品0. 5ul，最后用灭菌重蒸馏水补足25ul。在ABI7300型荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为50°C保温2分钟，95°C保温2分钟，再运行40个循环，每个循环包括在95°C保温15秒，再在60°C保温I分钟；(4)用软件SDS2. 2进行结果分析，如图I所示，为阳性对照品的Realtime PCR曲线，呈S形。如图2所示,为阴性对照品的Realtime PCR曲线，为非S形。如图3所示,为检测样品的Realtime PCR曲线，呈S形。得出判断，该样品为携带mdfA基因菌株。携带mdfA基因菌株可使多种消毒剂如溴化乙锭、结晶紫、普鲁黄和罗丹明等的 MIC值几倍或几十倍的升高，对消毒剂表现为耐受。利用本发明对超过100例大肠埃希菌样本的检测结果显示，根据上述方法进行的 mdfA基因携带情况检出率可达99%以上，可重复性达到100%。而琼脂糖凝胶电泳法的检出率约70%，如图4所示，为mdfA基因检测样品的琼脂糖凝胶电泳图；本发明与直接测序法相比，结果一致性可达到99. 5%以上，如图5所示，为mdfA基因检测样品的测序图。
权利要求
1.大肠埃希菌中HidfA基因的检测引物，其特征在于，包括(A)· mdfA 基因正向引物5' -ttccctctctgtctggtgct-31 ；(B)· mdfA 基因反向引物5' -cccagcagccattgtaaaaa-3'。
2.一种大肠埃希菌中mdfA基因的检测方法，其特征在于，采用权利要求I所述的大肠埃希菌中mdfA基因的检测引物，具体步骤为第一步取经培养后鉴定为大肠埃希菌阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带mdfA基因的大肠埃希菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成mdfA序列，构建携带mdfA基因的重组质粒为阳性对照品；第二步用无菌水配制浓度为5-15umol/L的mdfA基因正向引物溶液，浓度为5-15umol/L的mdfA基因反向引物溶液以及浓度为5-15umol/L的mdfA基因检测探针溶液；mdfA基因正向引物的序列为5 ' -ttccctctctgtctggtgct-3 ' , mdfA基因反向引物的序列为5 ' -cccagcagccattgtaaaaa-3 1 , mdfA基因检测探针的序列为 FAM-tggcgggcgggatg-MGBNFQ ；第三步在每一个PCR反应孔中依次加入PCR Master Mix 10_15ul和第二步得到的 mdfA基因正向引物溶液O. I-Iul、mdfA基因反向引物溶液O. I-Iul、mdfA基因检测探针溶液O. Ι-lul，然后在不同的PCR反应孔中分别加入第一步得到的检测样品、阴性对照品及阳性对照品O. Ι-lul，用灭菌重蒸馏水补足25ul ;在荧光定量PCR仪上进行反应，反应条件为40-60°C保温1-3分钟，80-10(TC保温1_3分钟，再运行30-50个循环，每个循环包括在 80-100。。保温 10-20 秒，再在 50-70°C保温 O. 5-1. 5 分钟；第四步用软件SDS2. 2进行结果分析，PCR结果呈S形曲线即为携带mdfA基因。
全文摘要
本发明公开了一组大肠埃希菌中mdfA基因的检测引物及使用该引物的检测方法。所述的大肠埃希菌中mdfA基因的检测引物其特征在于，包括mdfA基因正向引物；5′-ttccctctctgtctggtgct-3′；mdfA基因反向引物5′-ccagcagccattgtaaaaa-3′。检测方法为取经培养后鉴定为大肠埃希菌阳性的临床样本分离株，高温灭活，提取样本DNA，作为检测样品；取不携带mdfA基因的大肠埃希菌菌株，高温灭活，提取样本DNA，作为阴性对照品；人工合成mdfA序列，构建携带mdfA基因的重组质粒为阳性对照品；分别进行PCR反应。本发明检测率高、可重复性强。
文档编号C12R1/19GK102605053SQ20121003313
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月14日 优先权日2012年2月14日
发明者傅咏南, 张奕, 王校 申请人:上海中优医药高科技有限公司