用于检测CYP2C19基因多态性的引物、探针及检测试剂盒的制作方法

本发明涉及体外核酸检测，尤其是涉及采用荧光定量pcr(fq-pcr)技术用于检测cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多态性的引物、探针及检测试剂盒。
背景技术：
：cyp2c19是一种十分重要的药物代谢酶，人cyp2c19基因位于10号染色体上，长约90.21kb，含9个外显子和8个内含子。cyp2c19遗传多态性可导致酶活性的个体差异，从而产生血药浓度的个体差异。临床上大约2％的药物都由cyp2c19催化代谢，包括氯吡格雷、s-美芬妥英、奥美拉唑、伏立康唑、安定、去甲安定等药物的代谢。cyp2c19遗传变异导致的个体差异，使人群出现超快代谢者(ultrarapidmetabolizer，um)、快代谢者(extensivemetabolizer，em)、中间代谢者(intermediatemetabolizer，im)和慢代谢者(poormetabolizer，pm)4种表型。cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)是中国人群中存在的2种导致cyp2c19酶缺陷的主要等位基因。cyp2c19*2导致剪接缺失，cyp2c19*3为终止密码子突变。em个体只携带cyp2c19*1等位基因，im个体携带cyp2c19*2或cyp2c19*3杂合子基因型；pm个体包括cyp2c19*2/*2、cyp2c19*2/*3和cyp2c19*3/*3基因型。东方人群中75％～85％的pm由cyp2c19*2所致，约20％～25％的pm由cyp2c19*3所致。目前常用的基因分型方法大致可分为三类：一是基于凝胶电泳的技术，如pcr反应结合限制性酶切片段长度多态性分析(rflp)，多重pcr，等位基因特异性扩增等；二是基于荧光标记杂交反应的基因分型技术，包括寡核苷酸连接分析，焦磷酸法dna测序，直接杂合子测序以及等位基因特异性引物延伸等。以上二种方法都是在pcr扩增反应之后，再采取不同的方法检测多态性位点。三是基因芯片技术，基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的dna片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维dna探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。基因芯片技术由于高通量等优点在snp检测中得到大量应用，但也存在检测时条件难以控制、重复性差，准确性低，易出现假阳性、假阴性结果、灵敏度较低等缺点。此外，还有磁珠/pcr荧光探针法、怛温扩增法、pcr溶解曲线法、pcr+导流杂交法等方法。上述各种方法都具有各自的优缺点及适用性。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多态性检测的引物。本发明的第二目的在于提供一种用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多态性检测的探针。本发明的第三目的在于提供一种用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多态性检测的检测试剂盒。所述用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多态性检测的引物如下：cyp2c19*2(rs4244285)-f:5’-ccagagcttggcatattgtatct-3’cyp2c19*2(rs4244285)-r:5’-tgtccatcgattcttggtgttct-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-tctgctccattattttccagaaacg-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-cttcagggcttggtcaatatagaat-3’。所述用于cyp2c19基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多态性检测的特异识别探针序列及标记荧光染料如下：fam-5’-tgattatttcccgggaacccataac-3’bhq1hex-5’-tgattatttcccaggaacccataactt-3’-bhq1rox-5’-caccccctggatccaggta-3’bhq2cy5-5’-caccccctgaatccaggtaag’-bhq2。根据cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遗传多态基因序列设计标记的不同荧光染料的特异识别探针对，探针可以针对cyp2c19基因多态性位点特异识别，可通过对荧光信号的检测判断样本的基因型。所述用于基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多态检测试剂盒，采用四种不同荧光基团标记的探针在同一反应管内同时指示四个目标片段(snp位点上rs4244285的g型基因和a型基因、rs4986893的g型基因和a型基因)的存在情况，且在反应条件下无交叉反应，特异性好。所述用于基因cyp2c19*2(rs4244285，c.681g>a)和cyp2c19*3(rs4986893，c.636g>a)多态检测试剂盒包括反应体系(pcrmix)：10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，(1.5～3.0)mmol/lmgcl2，2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶，1μmol/l引物及标记探针；阴性对照：灭菌超纯水。本发明采用荧光定量pcr(fq-pcr)技术检测cyp2c19基因rs4244285和rs4986893多态性。fq-pcr的工作原理是利用taq酶的5’→3’外切酶活性，在pcr反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的dna模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团，靠近3’端标以荧光淬灭基团，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当pcr反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当pcr进入延伸(复制)期，tap酶从引物3’端开始,随新链延伸沿dna模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’→3’端外切酶活性作用，将探针切断(切口平移效应)。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来。pcr反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。不同的等位基因探针由于标记的荧光染料不同，因此所发荧光信号不同，可通过对荧光信号的检测判断样本的基因型。本发明采用fq-pcr技术进行检测，利用不同荧光基团标记的探针实现单管封闭同时检测样品中cyp2c19基因rs4244285和rs4986893同时存在的四种基因型，克服
背景技术：
中的各种缺陷，具有检测结果直观、快速、准确、高通量、低成本、无污染等优点。附图说明图1为采用纯水为阴性对照时，fam(465-510nm)检测频道无扩增曲线。图2为采用纯水为阴性对照时，hex(533-580nm)检测频道无扩增曲线。图3为采用纯水为阴性对照时，rox(533-610nm)检测频道无扩增曲线。图4为采用纯水为阴性对照时，cy5(618-660nm)检测频道无扩增曲线。图5为采用rs4244285的g型基因的阳性质粒作对照，fam检测频道有一条扩增曲线。图6为采用rs4244285的g型基因的阳性质粒作对照，hex检测通道无扩增曲线。图7为采用rs4244285的a型基因的阳性质粒作对照，hex检测频道有一条扩增曲线。图8为采用rs4244285的a型基因的阳性质粒作对照，fam检测通道无扩增曲线。图9为采用rs4986893的g型基因的阳性质粒作对照，rox检测频道有一条扩增曲线。图10为采用rs4986893的g型基因的阳性质粒作对照，cy5检测通道无扩增曲线。图11为采用rs4986893的a型基因的阳性质粒作对照，cy5检测频道有一条扩增曲线。图12为采用rs4986893的a型基因的阳性质粒作对照，rox检测通道无扩增曲线。图13为同一反应管内加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遗传多态性的四种基因片段的阳性质粒为模板，fam检测频道有扩增曲线。图14为同一反应管内加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遗传多态性的四种基因片段的阳性质粒为模板，hex检测频道有扩增曲线。图15为同一反应管内加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遗传多态性的四种基因片段的阳性质粒为模板，rox检测频道有扩增曲线。图16为同一反应管内加入cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遗传多态性的四种基因片段的阳性质粒为模板，cy5检测频道有扩增曲线。具体实施方式以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。一、材料1、仪器：实时荧光pcr仪、移液器、离心机。2、引物、探针设计：本发明同时设计了两对高效特异引物用于目标基因的检测，同时设计了两对探针检测相应的cyp2c19基因rs4244285和rs4986893遗传多态位点。引物、探针系列如下：引物：cyp2c19*2(rs4244285)-f:5’-ccagagcttggcatattgtatct-3’cyp2c19*2(rs4244285)-r:5’-tgtccatcgattcttggtgttct-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-tctgctccattattttccagaaacg-3’cyp2c19*3(rs4986893)-f:5’-cttcagggcttggtcaatatagaat-3’。探针：fam-5’-gatgaaatcggctcccgc-3’bhq1hex-5’-gatgaaatcgactcccgcag-3’-bhq1rox-5’-agacactttcttcactggtcag-3’bhq2cy5-5’-agacacttgcttcactggtc-3’-bhq2。3、试剂10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，2.5mmol/lmgcl2,2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶。二、方法1、样本选择医院体检人群样本78例。2、基因组dna提取用常规分子生物学方法或市售试剂合从抗凝全血中提取人基因组。3、实时荧光pcr扩增与检测实时荧光pcr反应体系：10mmol/ltris-hclph8.0，50mmol/lkcl，2.5mmol/lmgcl2,2.0mmol/ldntp溶液，0.001mmol/ledta，0.01mmol/lddt，0.005％tween20，1utaqhs，0.5uung酶，1μmol/l引物及荧光探针，30ng人基因组dna。实时荧光pcr反应在rochelightcycler480ⅱ仪器上按以下条件进行扩增检测：第一阶段：95℃2min。第二阶段：95℃20sec，62℃20sec(荧光采集)，72℃20sec(40cycles)四个荧光检测频道分别为fam、hex、rox、cy5。三、结果分析阴性对照：以纯水作模板的反应管内应无任何扩增曲线产生。阳性对照：阳性对照品为分别克隆到载体puc57上的四个dna片段(每个载体中dna片段分别含snp位点上rs4244285的g型基因、rs4244285的a型基因、rs4986893的g型基因、rs4986893的a型基因)，同一反应管内加入四种阳性质粒为模板，fam、hex、rox、cy5检测频道均应有扩增曲线产生。结果判定：样本反应管中若fam检测频道有扩增曲线产生则判定存在snp位点上rs4244285g型基因，hex检测频道有扩增曲线产生则存在rs4244285a型基因，若fam、hex检测频道同时有扩增曲线产生则rs4244285为杂合型。若rox检测频道有扩增曲线产生则判定存在rs4986893g型基因，若cy5检测频道有扩增曲线产生则判定存在rs4244285a型基因，若rox、cy5检测频道同时有扩增曲线产生则rs4986893为杂合型。为验证本发明的准确性，进行了78份基因组样本的验证实验，与测序结果对比，符合率达100％。结果如下表：结果(基因型)本发明检测结果(例)测序结果(例)符合率(％)rs4244285(g/g)4343100rs4244285(g/a)3030100rs4244285(a/a)55100rs4986893(g/g)7070100rs4986893(g/a)88100采用纯水为阴性对照时，fam(465-510nm)检测频道无扩增曲线如图1所示产生，采用纯水为阴性对照时，hex(533-580nm)检测频道无扩增曲线如图2所示产生，采用纯水为阴性对照时，rox(533-610nm)检测频道无扩增曲线如图3所示产生，采用纯水为阴性对照时，cy5(618-660nm)检测频道无扩增曲线如图4所示产生，采用rs4244285的g型基因的阳性质粒作对照，fam检测频道有一条扩增曲线如图5所示产生。图5和图6的结果表明，在实验条件下含荧光基团fam的探针只对rs4244285的g型基因的目标片段有特异结合，荧光基团hex的探针不结合基因snp位点为g的目标片段，两种探针不存在交叉反应。图7和图8的结果表明，在实验条件下含荧光基团hex的探针只对rs4244285的a型基因的目标片段有特异结合，荧光基团fam的探针不结合snp位点为a的目标片段，两种探针不存在交叉反应。图9和图10的结果表明，在实验条件下含荧光基团rox的探针只对rs4986893的g型基因的目标片段有特异结合，荧光基团cy5的探针不结合snp位点为g的目标片段，两种探针不存在交叉反应。图11和图12的结果表明，在实验条件下含荧光基团hex的探针只对rs4986893的a型基因的目标片段有特异结合，荧光基团rox的探针不结合snp位点为a的目标片段，两种探针不存在交叉反应。图13～16的结果表明，同一反应管同时存在四种基因型，反应体系不影响试剂合的灵敏性、特异性。序列表<110>庄江兴，厦门市同普生物科技有限公司<120>用于检测cyp2c19基因多态性的引物、探针及检测试剂盒<130>2017<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1ccagagcttggcatattgtatct23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2tgtccatcgattcttggtgttct23<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<400>3tctgctccattattttccagaaacg25<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<400>4cttcagggcttggtcaatatagaat25<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5gatgaaatcggctcccgc18<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6gatgaaatcgactcccgcag20<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7agacactttcttcactggtcag22<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8agacacttgcttcactggtc20当前第1页12