一种用于检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，具体为一种用于检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的分子标记及其应用。

背景技术：

抗生素类药物作为预防、治疗细菌类疾病的首选药物在畜牧业生产中被广泛使用，但由于使用不当和用药压力，出现了耐药现象。沙门氏菌是一种常见的人兽共患病原菌，对动物和人都有很大的危害。沙门氏菌在长期进化过程中不断变化，也出现了多重耐药现象。禽类是沙门氏菌的主要宿主之一，各种日龄的禽类都能被感染。作为重要的食源性病原菌，沙门氏菌可以通过污染的畜禽肉产品、蛋类、奶类、甚至海洋产品等多种渠道感染人类，而感染情况主要取决于细菌血清型和使用者的身体状况。体质低弱的人群极易感染，感染后有多种临床表现，主要以急性肠胃炎为主。

技术实现要素：

本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够快速检测沙门氏菌的携带情况，为研究肉鸡屠宰生产链沙门氏菌耐药性与耐药基因的关系提供参考，本发明提供了一种用于检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的分子标记及其应用。

技术方案：一种用于检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

优选的，所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。

表1分子标记序列

所述分子标记在制备检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因试剂盒中的应用。

优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。

优选的，所述试剂盒检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的步骤包括：

(1)取样：选取纯化后的肉鸡沙门氏菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；

(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200～500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

优选的，所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。

优选的，所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

优选的，所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。

优选的，所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。

有益效果：(1)本发明所述分子标记能够快速检测沙门氏菌的携带情况，为研究肉鸡屠宰生产链沙门氏菌耐药性与耐药基因的关系提供参考，也为控制肉鸡屠宰生产链沙门氏菌的耐药性提供基础数据；(2)本发明所述分子标记的检测结果具有稳定性高的优点。

附图说明

图1是实施例1～3检测结果图；

其中，m为分子量为2000bp的maker；1为实施例1pcr产物电泳结果；2为实施例2pcr产物电泳结果；3为实施例3pcr产物电泳结果。

具体实施方式

实施例1

一种用于检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。

所述分子标记在制备检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因试剂盒中的应用。

所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。

所述试剂盒检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的步骤包括：

(1)取样：选取纯化后的肉鸡沙门氏菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；

(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。

所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。

所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。

实施例2

一种用于检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。

所述分子标记在制备检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因试剂盒中的应用。

所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。

所述试剂盒检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的步骤包括：

(1)取样：选取纯化后的肉鸡沙门氏菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入40μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；

(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释400倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释60倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。

所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。

所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。

实施例3

一种用于检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。

所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5，端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。

所述分子标记在制备检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因试剂盒中的应用。

所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。

所述试剂盒检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的步骤包括：

(1)取样：选取纯化后的肉鸡沙门氏菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；

(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；

(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释500倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；

(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释10倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；

(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。

所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。

所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。

所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。

所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。

sequencelisting

<110>苏州乔纳森新材料科技有限公司

<120>一种用于检测肉鸡沙门氏菌环丙沙星耐药基因的分子标记及其应用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gagtactcaccagtcacagaaaagc25

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gacttcccgtcgtgtagataac22

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tggtccggaggccagacgtg20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

acccacaccgttgcgggaat20

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gcgctcaaggcagatggcatt21

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gcgtttgataccggcacccgt21