用于莲藕源性成分检测的引物探针及方法和试剂盒与流程

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于莲藕源性成分检测的寡核苷酸引物和探针，用于测定莲藕源性成分的实时荧光PCR检测方法，用于快速检测莲藕源性成分的实时荧光PCR检测试剂盒以及莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测莲藕源性成分中的应用。。

背景技术：

莲藕(Nelumbonucifera) 为睡莲科莲属多年生大型水生草本植物，原产中国和印度，历史悠久，种质资源丰富。由于莲藕富含碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质、鞣质等，以莲藕为原料的藕粉及果汁等产品深受国内外消费者喜爱和食品研究者的关注。

然而，为牟取利益，有些不法分子在藕粉产品中掺杂玉米、小麦、马铃薯、红薯和木薯等其他廉价的可食用淀粉。这些掺假行为，大多可利用扫描电镜法通过不同淀粉颗粒的超微形貌特性进行鉴别，但该方法无法对掺假藕粉中的木薯淀粉或甘薯淀粉进行鉴别，因为藕粉中除长棒形的典型藕粉颗粒外，还有一些小的不成熟的类似于球体碎块、半球体或大半个球体的小型藕粉颗粒，这些颗粒与木薯淀粉和红薯淀粉颗粒在超微形貌上极其相似。另外国家标准GB/T25733-2010《藕粉》中采用光学显微镜和偏光显微镜等检测手段判定藕粉，并将藕粉分级。但此法只能鉴别出类似于典型藕粉颗粒的淀粉颗粒，却无法确定这些长棒形颗粒是真的典型藕粉颗粒，还是马铃薯或芭蕉芋等其他大型淀粉颗粒。另外也有研究通过差示扫描量热仪对藕粉等常见几种淀粉的糊化过程进行比较，发现藕粉与其他淀粉在糊化吸热峰上有明显的差别，基于此也可将藕粉与其他淀粉进行区分。

分子生物学技术的发展，弥补了常规化学检测技术的诸多不足，通过鉴定物种品种DNA水平上的差异来鉴定品种真实性和纯度，具有准确可靠、成本较低、不受环境因素影响，便于实现鉴定自动化，且可鉴定表型上难于鉴别的品种等。近几年来，实时荧光PCR技术已经广泛应用于肉类、水产品、奶制品等食品真实属性鉴别、食源性过敏原监测、转基因食品检测、食源性微生物筛查等领域。另外在谷物鉴别中也有所应用，如采用实时荧光PCR方法可准确鉴别小麦、大麦、燕麦及黑麦，检测灵敏度可达0.01%。

目前，国内外尚未见报道能够快速、简便、特异且灵敏地检测藕粉等样品中莲藕源性成分的方法和试剂盒。

因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的莲藕源性成分的检测方法，进行藕粉等样品中莲藕源性成分的检测。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于，提供准确检测莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针。

本发明的另一个目的在于，提供准确测定莲藕源性成分的实时荧光PCR检测方法。

本发明的另一个目的在于，提供准确测定莲藕源性成分的实时荧光PCR检测试剂盒。

本发明的还一个目的在于，提供莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在准确检测藕粉等样品中莲藕源性成分中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的发明人根据莲藕ITS1-5.8S-ITS2间区设计了能特异性鉴别样品中莲藕源性成分的寡核苷酸引物对和探针，能从样品DNA中高效特异扩增出一段较短的莲藕特异性基因片段。根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于实时荧光PCR方法检测莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对和荧光标记探针，所述引物对和探针是根据ITS1-5.8S-ITS2间区序列在不同物种中具有差异性的特点而设计的。所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为Lotus root-F：CCATGGAAGGGTGCATAATC（SEQ ID No.1），所述下游引物为Lotus root-R：GAGATATCCGTTGCCGAGAG（SEQ ID No.2）；所述探针为Lotus root：ATTGTTGGGTGTTTTGCCTC（SEQ ID No.3），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方案中，本发明提供的莲藕特异性检测组合物，所述组合物包含特异性寡核苷酸引物对和探针。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于实时荧光PCR方法定性检测莲藕源性成分的组合物，所述组合物包含莲藕特异性寡核苷酸引物对和探针，其中所述莲藕特异性引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供莲藕源性成分的实时荧光PCR定性检测方法，所述方法包括使用针对莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针，所述引物对和探针是根据g3pdh基因序列在不同物种中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，本发明的莲藕源性成分的实时荧光PCR定性检测方法中，所使用的莲藕特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方案中，所述的PCR扩增条件为95℃，10 min；95℃15 s，60℃1 min，共40个循环。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于准确检测样品中莲藕源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明用于实时荧光PCR方法检测莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对以及探针和使用说明书。在本发明的试剂盒优选实施方案中，本发明的莲藕源性成分定性检测特异性寡核苷酸引物对是根据ITS1-5.8S-ITS2间区序列在不同物种中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，所述试剂盒的莲藕特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述试剂盒中探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于准确定性检测莲藕源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的用于实时荧光PCR方法鉴别莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针以及使用说明书。在试剂盒的一个优选实施方案中，所述试剂盒中包含莲藕特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和莲藕特异性探针SEQ ID No.3，在莲藕ITS1-5.8S-ITS2间区探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速检测莲藕源性成分的实时荧光PCR扩增条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是95℃，10 min；95℃15 s，60℃1 min，共40个循环。在一个具体的实施方案中，本发明用于莲藕源性成分定性检测的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阴性对照品和阳性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为红薯DNA。

根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的用于实时荧光PCR方法检测莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测食品中莲藕源性成分中的应用。在一个优选的实施方案中，本发明提供藕粉、莲藕汁等样品中莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2 和特异性探针SEQ ID No.3，在莲藕ITS1-5.8S-ITS2间区探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的试剂盒在定性检测莲藕源性成分的应用。优选地，在本发明的上述应用中，所述试剂盒包括本发明的莲藕特异性寡核苷酸引物对和探针。更优选的，在本发明的上述应用中，所述试剂盒包括本发明的莲藕特异性寡核苷酸引物对和探针在检测莲藕源性成分中的应用。

本发明以莲藕DNA为检测基础，根据ITS1-5.8S-ITS2间区序列在不同物种中具有差异性的特点，比对分析了莲藕ITS1-5.8S-ITS2间区序列。根据这些序列设计引物，利用实时荧光PCR法定性检测样品中的莲藕源性成分。

实时荧光定量PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，随着PCR产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每产生一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。因此可以实时监控整个PCR反应过程，并最终检测出待测样品的初始拷贝数，从而可检测待测食用淀粉中所含木薯源性成分。

本发明的实时荧光PCR检测方法采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。本发明的方法巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。本发明按照引物序列制成的试剂盒，可用于此类产品的定性检测，具有灵敏度高、特异性强、结果稳定可靠且避免交叉污染造成假阳性的优点。使用本发明的PCR检测方法和PCR检测试剂盒，可用于定性检测，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上藕粉、莲藕汁等样品中莲藕源性成分的检测等。

附图说明

图1显示的是实时荧光PCR特异性检测莲藕的结果，其中使用特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2及SEQ ID No.3检测，其中基线上方为莲藕样品的扩增曲线，基线下方为红薯、芋头、山药、马铃薯、木薯、葛根、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大米、荞麦、高粱、薏米、小米、绿豆、赤小豆、豇豆、豌豆、扁豆、菜豆、蚕豆、黄豆、枣、杏、百合、橄榄等28种样品及空白对照（无菌水）

图2是对实时荧光PCR特异性检测莲藕成分的绝对灵敏度进行评价，将莲藕DNA溶液10倍梯度稀释，依次为10 ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL以及空白对照（无菌双蒸水）。

图3是对实时荧光PCR特异性检测莲藕成分的相对灵敏度进行评价，将藕粉和玉米淀粉混合，使藕粉和玉米淀粉的质量比分别为100%、50%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%。

图4是利用本发明建立的实时荧光PCR方法对市售12份藕粉样品进行检测的结果。基线以上为阳性对照（莲藕DNA）及藕粉样品，基线位置为阴性对照和空白对照（无菌双蒸水）。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

本实施例为通过如下试验对莲藕的引物对和探针进行特异性和灵敏度评价。

通过检测ITS1-5.8S-ITS2间区序列，可以确定莲藕引物探针组合的特异性和检测灵敏度。反应体系为：Fast Start Universal PCR Master Mix 12.5 μL；探针(10 μM) 0.5μL；上、下游引物(10 μM)各0.5μL；模板DNA 5μL；加ddH2O至总体积为25μL。反应程序为95℃ 10 min；95℃ 15 s；60℃ 1 min，40个循环。

所使用的检测莲藕的引物及探针序列为：

引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，探针序列为SEQ ID No.3，3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

所使用的检测主要仪器：

微量移液器(10 µL 、100 µL 、1000 µL，Eppendorf)、荧光定量PCR仪(ABI 7500，Applied Biosystems)、高速台式离心机(Pico17 Thermo，)等。

检测主要试剂：

氯仿、异丙醇分别购于北京六合通公司；CTAB裂解液(20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris、0.02 mol/L Na2-EDTA)、CTAB沉淀液(5 g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl)、1.2 mol/L NaCl均为本实验自行配制；Fast Start Universal Probe Master Mix (Rox)购于罗氏公司；引物及探针由上海英骏生物科技有限公司合成等。

检测主要步骤：

1 DNA提取

检测样本：(1)莲藕、红薯、芋头、山药、马铃薯、木薯、葛根、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大米、荞麦、高粱、薏米、小米、绿豆、赤小豆、豇豆、豌豆、扁豆、菜豆、蚕豆、黄豆、枣、杏、百合、橄榄等29种样品用于特异性分析；(2)将提取的莲藕DNA溶液用无菌水分别稀释为10 ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL的浓度，用于分析引物探针组合的绝对灵敏度；(3)将藕粉和玉米淀粉混合，使藕粉和玉米淀粉的质量比分别为100%、50%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%，以确定莲藕特异性引物探针组合的相对灵敏度。

称取0.1 g样品粉末至一洁净2.0 mL离心管中，加入1.5 mL CTAB裂解液，65℃ 1 h，间期上下颠倒混匀几次；8000 rpm 15 min，取1 mL上清液至1只洁净2.0 mL离心管中，加入700 μL氯仿，剧烈混匀30 s，14500 rpm 10 min，分别取650μL上清液至洁净2.0 mL离心管中，加入1300 μL CTAB沉淀液，剧烈混匀30 s，室温静置1 h；14500 rpm 10 min，弃上清液，加入350μL 1.2 M NaCl，剧烈振荡30 s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30 s，14500 rpm 10 min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃ 1 h，14500 rpm 20 min，弃上清液，加入500μL 70%乙醇，混匀后，14500 rpm 20min，弃上清液，晾至风干，加入100μL ddH2O溶解，4℃储存备用。

2 实时荧光PCR检测所用引物和探针

引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；

探针序列为SEQ ID No.3，3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

3 实时荧光PCR反应体系：

Fast Start Universal PCR Master Mix 12.5 μL

探针(10 μM) 0.5μL

上游引物(10 μM) 0.5μL

下游引物(10 μM) 0.5μL

模板DNA 5μL

加ddH2O至总体积为25μL

注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；

4 实时荧光PCR反应参数：

95℃ 10 min

95℃ 15 s

60℃ 1 min

40个循环。

注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。

如图1所示，利用实时荧光PCR特异性检测莲藕的ITS1-5.8S-ITS2间区序列时，除莲藕样品出现典型的S型扩增曲线外，其它样品：红薯、芋头、山药、马铃薯、木薯、葛根、玉米、小麦、燕麦、大麦、黑麦、大米、荞麦、高粱、薏米、小米、绿豆、赤小豆、豇豆、豌豆、扁豆、菜豆、蚕豆、黄豆、枣、杏、百合、橄榄等28种样品及空白对照(ddH2O)均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的引物探针对莲藕样品特异。

为确定莲藕特异性引物探针组合的绝对检测限，将提取的莲藕DNA溶液用无菌水分别稀释为10 ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL、0.0001ng/μL的浓度，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，结果如图2所示。莲藕DNA浓度为10 ng/μL、1 ng/μL、0.1 ng/μL、0.01 ng/μL、0.001 ng/μL时有特异性扩增曲线，而浓度降至0.001 ng/μL以下时，无特异性扩增曲线出现。实验结果表明建立的实时荧光PCR检测方法能够检出莲藕成分的含量为0.001 ng/μL。

将藕粉和玉米淀粉混合，使藕粉和玉米淀粉的质量比分别为100%、50%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%，分别按上述条件进行实时荧光PCR扩增，以确定莲藕特异性引物探针组合的相对灵敏度(图3)。实验结果说明该方法检测莲藕成分的相对灵敏度为1%。

实施例2

本实施例提供准确检测样品中莲藕源性成分的试剂盒。所述试剂盒包括本发明用于实时荧光PCR方法鉴别莲藕源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针以及使用说明书。所述试剂盒包括引物对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2 和探针SEQ ID No.3，探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMAR，5’端连接有一个荧光报告基团FAM，所述使用说明书中给出了PCR扩增条件，该条件为95℃ 10 min；95℃ 15 s；60℃ 1 min，40个循环。对于不同仪器，反应参数做适当调整。

为确保建立的方法具有可行性，选取12份市售藕粉样品，与实施例1所述的方法相同，进行实时荧光PCR检测，其中以无菌双蒸水作为试剂盒阴性对照品，以莲藕DNA作为试剂盒阳性对照品。

如图4所示，利用实时荧光PCR检测莲藕ITS1-5.8S-ITS2间区序列时，纯莲藕DNA以及12份藕粉样品均在基线以上具有典型的荧光扩增曲线，空白对照扩增曲线均在基线位置，表明该方法能有效检测出藕粉成分。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。