戊型肝炎病毒实时荧光逆转录PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法与流程

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。

背景技术：
：

戊型肝炎(hepatitive)是由戊型肝炎病毒(hepatitisevirus,hev)引发的一种严重危害人类健康的急性传染病。近年来，戊型肝炎发病的绝对数和发病率均呈连续、快速增长态势。因此，提高戊型肝炎的诊断和治疗水平，具有重要的意义。目前，戊型肝炎的诊断方法很多，例如病毒的分离鉴定、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应等。其中，聚合酶链式反应(polymeasechainreaction(pcr)在理论和应用上取得了突破性的进展，受到业内的高度重视。可是，由于戊型肝炎病毒基因类型比较复杂，在应用pcr方法时，引物设计难度较大，包括引物探针的序列设计与选择、引物/探针用量、镁离子用量、反应条件和阴/阳性对照品等多项技术参数尚缺乏成熟的技术信息，因而还没有形成适应范围大、操作简便、准确可靠的实时检测试剂盒，限制了该方法的推广和普及。

技术实现要素：
：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。

本发明的第一个目的是提供一种戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：hev-f1：5’-gtgcttttgcctatgctg-3’(如seqidno.1所示)，hev-r1：5’-ggttggttggatgaatatagg-3’(如seqidno.2所示)。以基因iii型戊型肝炎病毒序列(genebank登陆号为：ku513561.1)为模板，扩增的目的片段的序列如seqidno.10所示。

本发明的第二个目的是提供一种戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：hev-p1：5’-agaatcaaccctgtcacc-3’(如seqidno.3所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

所述的荧光报告基团优选为fam，所述的荧光淬灭基团优选为bhq-1。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述的检测引物和/或检测探针的检测试剂盒。

优选，所述的检测试剂盒包括10×buffer、25mmmgcl2、10mmdntpmix、rt-pcrmix(百泰克)、检测引物hev-f1和hev-r1、检测探针hev-p1、depc-ddh2o、阴性对照品和阳性对照品。

所述的阴性对照品优选为depc-ddh2o。

所述的阳性对照品优选为携带如seqidno.10所示序列的质粒。

本发明的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样本总rna作为模板，使用上述的检测引物hev-f1和hev-r1以及检测探针hev-p1，与实时荧光逆转录pcr扩增用的反应液、逆转录酶、rnaseinhibitor和taqdna聚合酶混合形成扩增反应体系，进行实时荧光逆转录pcr扩增，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团记录的荧光信号，读取并记录待测样品的ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有戊型肝炎病毒。

所述的待测样品可以为饮用水、食品或粪便等。

所述的实时荧光逆转录pcr扩增，其反应条件优选为：45℃10min；95℃15min；95℃，15s，60℃1min，40个循环；60℃时进行荧光采集。结果判断标准：以实时荧光逆转录pcr检测扩增曲线指数期明显，且ct<39为阳性判定原则，如果扩增曲线指数期明显且ct<37可直接判定为阳性，如果ct值在37～39之间判断为可疑，需要加大模板量进行重复实验，若出现指数期明显的扩增曲线方可判定为阳性，否则为阴性。

本发明针对戊型肝炎病毒，设计和筛选了特异性检测引物、探针以及含有该检测引物和探针的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过实时荧光逆转录pcr扩增，进而确认待测样品中是否含有戊型肝炎病毒的检测方法。本发明的检测试剂盒和检测方法对戊型肝炎病毒的各个基因型都能够实现快速检测，具有特异性强、灵敏度高、适应范围广、操作简便快捷、检测结果准确可靠、检测时间短的优点，灵敏度达到1×10³copies/ml，解决了传统检测方法耗时长、灵敏度低等问题，特别适合大规模样品的快速检测，为传染源调查、传播环境、病毒来源等工作奠定基础。

附图说明：

图1是戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr扩增曲线图；引物为hev-f1和hev-r1，探针为hev-p1。

图2是戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr扩增曲线图；引物为hev-f2和hev-r2，探针为hev-p2。

图3是戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr扩增曲线图；引物为hev-f3和hev-r3，探针为hev-p3。

图4是不同浓度探针的戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr扩增曲线图。

图5是不同浓度mg²⁺的戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr扩增曲线图。

图6是延伸温度为58℃时戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr扩增曲线图。

图7是延伸温度为60℃时戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr扩增曲线图。

图8是延伸温度为62℃时戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr扩增曲线图。

图9是戊型肝炎病毒灵敏度试验实时荧光逆转录pcr扩增曲线图。

图10是戊型肝炎病毒特异性试验实时荧光逆转录pcr扩增曲线图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明以hev-ⅲ型(genebank登陆号为：ku513561.1)的orf2基因序列为参考设计特异性引物和探针，orf2基因具有种属特异性(鉴别hev的特异性)、又有保守性(与1234亚型分型无关，4个亚型的序列一致)，因此，设计的引物和探针可以实现对hev各个亚型的检测。探针的5’端标记有荧光报告基团fam，探针的3’端标记有荧光淬灭基团bhq-1(见表1)。

表1检测引物和检测探针

戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr的反应体系见表2。

表2实时荧光逆转录pcr反应体系

戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测试剂盒的反应条件为：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(荧光采集)，40cycles。试剂盒内阳性对照品为携带如seqidno.10所示序列的质粒，阴性对照品为depc-ddh2o。

实施例1：

1.检测探针与检测引物的设计与选择

1.1检测引物与检测探针的设计

1.1.1检测引物和检测探针设计原则

根据taqman荧光探针pcr检测方法，确定了以下引物和探针设计原则：

(1)引物和探针的长度：每条引物长度为18～25个碱基，荧光探针长度为20～30个碱基。

(2)引物和探针中gc％要求在30％～70％，且荧光探针的tm值应高于引物的tm值5℃以上。

(3)引物和探针自身、引物和探针之间的3'端尽可能避免碱基配对。

(4)引物和探针自身、引物和探针之间尽可能避免6对以上的连续碱基配对。

(5)选用的引物和探针要求设计在靶基因中的保守区，和其它物种无交叉反应。探针位于一对引物之间的区域。

1.1.2引物和探针的设计

遵循上述设计原则，对基因iii型戊型肝炎病毒序列(genebank登陆号为：ku513561.1)结合其它基因型戊型肝炎病毒序列进行分析，针对病原体设计三组引物和探针。探针的5’端标记有荧光报告基团fam，3’端标记有荧光淬灭基团bhq-1。

将设计的引物和探针分别命名为：引物hev-f1(如seqidno.1所示)和hev-r1(如seqidno.2所示)及对应的探针hev-p1(如seqidno.3所示)。引物hev-f2(如seqidno.4所示)和hev-r2(如seqidno.5所示)及对应的探针hev-p2(如seqidno.6所示)。引物hev-f3(如seqidno.7所示)和hev-r3(如seqidno.8所示)及对应的探针hev-p3(如seqidno.9所示)。

1.2阳性对照品的建立

本发明的阳性对照品为化学合成的含目的扩增片段序列的质粒。

将合成的质粒分别命名为hev-z1(携带有以hev-f2和hev-r2作为引物，基因iii型戊型肝炎病毒作为模板扩增的如seqidno.10所示的序列、hev-z2(含有以hev-f2和hev-r2作为引物，基因iii型戊型肝炎病毒作为模板扩增的目的扩增片段)、hev-z3(含有以hev-f3和hev-r3作为引物，基因iii型戊型肝炎病毒作为模板扩增的目的扩增片段)。

将浓度为1×10¹²copies/ml的质粒hev-z1、hev-z2和hev-z3分别稀释100000倍，分别得到浓度为1×10⁷copies/ml的质粒hev-z1、hev-z2和hev-z3，然后分别进行10倍梯度稀释，得到质粒浓度为1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的阳性对照品。

1.3引物和探针的选择

用步骤1.1.2设计的三组引物和对应的探针对稀释好的对应的阳性对照品进行实时荧光逆转录pcr扩增。具体为：以hev-f1和hev-r1作为引物，hev-p1作为探针，梯度稀释的质粒hev-z1作为模板进行实时荧光逆转录pcr扩增；以hev-f2和hev-r2作为引物，hev-p2作为探针，梯度稀释的质粒hev-z2作为模板进行实时荧光逆转录pcr扩增；以hev-f3和hev-r3作为引物，hev-p3作为探针，梯度稀释的质粒hev-z3作为模板进行实时荧光逆转录pcr扩增。确定最佳引物/探针组。

1.3.1检测样本

取步骤1.2中梯度稀释的3组质粒分别作为各自对应的引物/探针的检测样本(模板)。

1.3.2pcr反应体系

根据实验室以往的研究经验，将pcr反应体系配置为25μl体系，其反应体系见表3：

表3实时荧光逆转录pcr反应体系

a：分组

共3组，即3组不同的引物/探针组合，每组检测4个对应梯度稀释的阳性对照品，每个检测做2个复孔。

组1：以hev-f1和hev-r1作为引物，hev-p1为探针，浓度为1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z1质粒作为模板。

组2：以hev-f2和hev-r2作为引物，hev-p2为探针，浓度为1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z2质粒作为模板。

组3：以hev-f3和hev-r3作为引物，hev-p3为探针，浓度为1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z3质粒作为模板。

b：实时荧光逆转录pcr反应条件设置

根据试验以往研究经验，将实时荧光逆转录pcr反应条件设置为：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(荧光采集)，40cycles。

1.3.3检测结果

表4戊型肝炎病毒检测结果

注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。

由检测结果(表4)和扩增曲线图(图1～图3)可知，本实施例设计的3组引物及对应的探针，均符合要求，且引物hev-f1/hev-r1以及探针hev-p1的检测灵敏度最高，为最优组合。

2.实时荧光逆转录pcr反应体系的优化

2.1引物/探针用量研究

将步骤1.3中确定的最优引物/探针组合(引物hev-f1/hev-r1以及探针hev-p1)分别作为引物和探针，以hev-z1质粒作为模板来确定反应体系中引物/探针的用量。

2.1.1引物/探针用量

1)引物/探针用量分组

根据实验室以往的研究经验，设置3组，分别为：

组1：引物hev-f1/hev-r1各0.5μl；探针hev-z10.2μl。

组2：引物hev-f1/hev-r1各0.5μl；探针hev-z10.1μl。

组3：引物hev-f1/hev-r1各0.5μl；探针hev-z10.05μl。

2)反应体系设置

根据实验室以往的研究经验，pcr反应体系配置为25μl体系，3组的反应体系设置见表5。

表53组实时荧光逆转录pcr反应体系

2.1.2检测样本

以hev-f1和hev-r1为引物，hev-p1为探针，取步骤1.2中制备的梯度稀释的浓度为1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z1质粒作为检测样本(模板)。每组样本重复2次。

2.1.3反应条件

根据试验以往研究经验，将pcr反应条件设置为：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(荧光采集)，40cycles。

2.1.4检测结果及扩增曲线

表6检测结果

由上述检测结果(表6)和扩增曲线图(图4)可以看出：只有组2的各样本检测阳性率均为100％，组2的引物/探针用量为本发明试剂盒内的引物/探针的最佳用量。

2.1.5结论

根据以上的研究结果，确定引物和探针用量分别为：各引物在反应体系中的终浓度为0.4μm；探针在体系中的终浓度为0.08μm。

2.2镁离子用量研究

按照步骤2.1中确定的引物/探针的用量来确定最佳的镁离子用量。

2.2.1镁离子用量

1)镁离子用量分组

根据实验室以往的研究经验，设置3组，分别为：组1：mg²⁺在反应体系中的终浓度为3mm。组2：mg²⁺在反应体系中的终浓度为2.5mm。组3：mg²⁺在反应体系中的终浓度为2mm。

2)反应体系设置

表73组实时荧光逆转录pcr反应体系

2.2.2检测样本

以hev-f1和hev-r1为引物，hev-p1为探针，取步骤1.2中的梯度稀释的浓度为1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z1质粒作为检测样本(模板)。每组样本重复2次。

2.2.3反应条件

根据试验以往研究经验，将pcr反应条件设置为：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(荧光采集)，40cycles。

2.2.4检测结果及扩增曲线

表8检测结果

由上述检测结果(表8)和扩增曲线图(图8)可以看出：组1和组2各样本检测阳性率均为100％。但是mg²⁺浓度过高时，可能会影响其特异性，因此我们选择mg²⁺浓度较低的组2作为最佳的镁离子浓度。

2.2.5结论

根据以上的研究结果，确定镁离子在反应体系中的终浓度为2.5μm。

2.3反应条件研究

按照步骤2.1中确定的引物/探针用量和步骤2.2中确定的镁离子用量来确定最佳的反应条件。

2.3.1反应条件分组：

反应条件1：45℃10min；95℃15min；95℃15s，58℃1min(荧光采集)，40cycles。

反应条件2：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(荧光采集)，40cycles。

反应条件3：45℃10min；95℃15min；95℃15s，62℃1min(荧光采集)，40cycles。

2.3.2检测样本

以hev-f1和hev-r1为引物，hev-p1为探针，取步骤1.2中制备的梯度稀释的浓度为1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z1质粒作为检测样本(模板)。

2.3.3pcr反应体系设置

根据步骤2.1和2.2确定的最佳引物/探针用量及镁离子用量，pcr反应体系设置见表9。

表9实时荧光逆转录pcr反应体系

2.3.4检测结果及扩增曲线

表10检测结果

注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。

由上述检测结果(表10)和扩增曲线图(图6～8)可以看出：反应条件2中全部样品检测均为阳性，因此我们选择反应条件2的反应参数作为检测试剂盒的反应条件。

2.4试剂盒内阴性、阳性对照品研究

确定试剂盒内的阴性、阳性对照品，保证结果真实可靠。

2.4.1阳性对照品

1)样品：将浓度为1×10⁷copies/ml、1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml的hev-z1质粒等体积混合作为阳性对照品。

2)分组：共2组，每组每个样本做2个重复。组1：正常组：正常反应混合液，即现配制的反应混合液(不加模板)。组2：模拟失控组：反应混合液失效或效能下降，即反应混合液(不加模板)37℃放置7天。

2.4.2阴性对照品

1)样品：阴性对照品(depc-ddh2o)1份。

2)分组：共2组，每组每个样本做2个重复。组1：正常组：正常反应混合液，即现配制的反应混合液(不加模板)。组2：模拟失控组：正常反应混合液(不加模板)，取1μl阳性对照品加入到反应混合液中。

2.4.3反应体系及条件设置

2.4.3.1根据步骤2.1和2.2确定的最佳引物/探针用量及镁离子用量，反应体系设置见表11。

表11实时荧光逆转录pcr反应体系

2.4.3.2pcr反应条件设置：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(荧光采集)，40cycles。

2.4.4pcr检测

用正常组和模拟失控组的pcr反应体系，检测阳性对照品和阴性对照品。

2.4.5检测结果

2.4.5.1阳性对照品检测结果

表12阳性对照品检测结果

注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。

2.4.5.2阴性对照品检测结果

表13阴性对照品检测结果

注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。

2.4.5.3结论

从上述的表12和表13数据可知，模拟失控组的结果都是不正常的，而模拟失控组的抽提试剂或检测试剂的确是配制不正确，因此说明这种质量检验方法可以监控产品的质量。

产品中的质控方法用阳性对照品和阴性对照来监控结果的可靠性，意义如下：

(1)阳性对照品可以监控试剂的有效性以及操作的正确性等；

(2)阴性对照可以监控试剂、模板、环境等的阳性污染。

3试剂盒性能研究

3.1灵敏度实验

3.1.1阳性质粒稀释

经计算，hev-z1质粒原液的dna拷贝数浓度为1×10¹²copies/ml。将原液分别按表14进行稀释。

表14质粒浓度

3.1.2分组

以稀释好的阳性质粒为检测样本(模板)，每个浓度样本重复2次。

3.1.3反应体系

表16实时荧光逆转录pcr反应体系

3.1.4反应条件

45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(荧光采集)，40cycles。

3.1.5检测结果及扩增曲线

表17检测结果

由上述检测结果(表17)和扩增曲线图(图9)可以看出：样本浓度为1×10³copies/ml时，阳性检出率为100％；当样本浓度为5×10²copies/ml时，样本阳性率为0％。因此，我们选择1×10³copies/ml作为本发明的戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测试剂盒的分析灵敏度。

3.2特异性实验

以hev-f1/hev-r1作为引物，hev-p1作为探针，分别对基因i型、ii型、iii型和iv型戊型肝炎病毒及猪瘟病毒(csfv)、猪流感病毒(siv)、烟草花叶病毒和流感病毒进行实时荧光逆转录pcr扩增，每种样本重复2次。

3.2.1反应体系

表18实时荧光逆转录pcr反应体系

3.2.2反应条件

45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(荧光采集)，40cycles。

3.2.3检测结果及扩增曲线

表19检测结果

由上述检测结果(表19)和扩增曲线图(图10)可以看出：基因i型、ii型、iii型和iv型戊型肝炎病毒的检测结果均为阳性，猪瘟病毒(csfv)、猪流感病毒(siv)、烟草花叶病毒和流感病毒的检测结果均为阴性，说明本发明的检测试剂盒能够同时检测四种不同基因型戊型肝炎病毒，且具有高度的特异性。

4.研制总结

通过对引物/探针的序列设计与选择、引物探针用量、镁离子用量、反应条件和阴/阳性对照品等的研究，确定了本发明的戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测试剂盒的最佳引物/探针组、扩增体系和反应条件，并对其进行了分析灵敏度和特异性的分析。

4.1引物和探针的设计与选择：通过生物信息学分析及实验验证，最终戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测试剂盒最终的引物/探针，具体序列见表1。

4.2反应体系

4.2.1对试剂盒主要反应体系中的引物/探针用量、镁离子用量的研究，确定了最终的反应体系(见表20)。

表20实时荧光逆转录pcr反应体系

4.2.2通过反应条件的研究，确定本试剂盒的最终反应条件为：45℃10min；95℃15min；95℃15s，60℃1min(荧光采集)，40cycles。

4.2.3通过对试剂盒内阴性、阳性对照品的研究，确定了试剂盒内的质控品设置：阳性对照品为携带如seqidno.10所示序列的质粒；阴性对照品为depc-ddh2o。

5.试剂盒灵敏度和特异性性能评估

经研究，确定本试剂盒的分析灵敏度为1×10³copies/ml，且具有很好的特异性。

序列表

<110>广州机场出入境检验检疫局综合技术服务中心

<120>戊型肝炎病毒实时荧光逆转录pcr检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法

<160>10

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gtgcttttgcctatgctg18

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ggttggttggatgaatatagg21

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

agaatcaaccctgtcacc18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gcccggtcagccgtctgg18

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gtgaccgggttgattctcag20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

cggttccggcggtggtttct20

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gaatgctcagcaggataagggt22

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

agctcggaggacagaaaaagg21

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

ccgcatgacatcgacctcggg21

<210>10

<211>148

<212>dna

<213>基因iii型戊型肝炎病毒

<400>10

gtgcttttgcctatgctgcccgcgccaccggccggtcagccgactggccgccgtcgtggg60

cggcgcagcggcagtgccggcagtggtttctggggtgacagggttgattctcagcccttc120

gccctcccctatattcatccaaccaacc148