检测喀西茄抗根结线虫病SacMi基因的分子标记及引物和应用的制作方法

一、技术领域

本发明涉及一种检测喀西茄抗根结线虫病sacmi基因的分子标记及引物和应用，属于植物育种技术领域，专用于茄子育种材料中来源于喀西茄的抗根结线虫病基因sacmi的分子检测。

二、

背景技术：

茄子(solanummelongenal.)起源于亚洲东南亚热带地区，古印度为最早驯化地。我国栽培茄子的历史悠久，一般认为中国是茄子第二起源地。茄子是我国栽培较广的茄果类蔬菜之一，它不仅具有较高的营养价值，且食用方法也多种多样，是一种可以鲜干结合、周年供应、经济实惠的大宗蔬菜，深受广大生产者和消费者的欢迎。茄子根结线虫病是一种重要的土传性病害，近年来，随着设施茄子生产的发展和连作的不可避免，该病已成为茄子设施栽培的重要病害，发生和危害愈加严重，生产上对抗根结线虫病茄子品种的需求非常迫切。

种质资源的评价和利用是开展抗病育种研究的基础。研究表明，茄子栽培种种质资源中缺乏抗根结线虫病基因，高抗根结线虫病的基因存在于茄属近缘野生种质中，其中茄子的野生种喀西茄(s.aculeatissimum)具有高抗根结线虫病的优良特性。因此，发掘利用喀西茄的抗根结线虫病基因对茄子品种抗病性的改良具有重要意义。

三、

技术实现要素：

技术问题

本发明的目的在于根据喀西茄sacmi基因的核苷酸序列及其与番茄、辣椒抗根结线虫基因同源序列间的差异，设计pcr引物，获得sacmi基因的pcr特异标记，用于对种间杂交后代中sacmi基因的分子检测。

技术方案

本发明采取如下技术方案：

一种检测喀西茄抗根结线虫病sacmi基因的分子标记，其特征在于，该分子标记sacmi1100的序列为：seqidno：1。

所述的分子标记的pcr引物，其特征在于：上游引物sami02f为seqidno：2，下游引物sami02r为seqidno：3。

所述分子标记的应用，其特征在于，是指在苗期对喀西茄与栽培茄的种间杂交后代群体进行抗根结线虫病基因sacmi的快速检测中的应用，提高育种效率。

所述pcr引物的应用是指所述pcr引物在喀西茄抗根结线虫病sacmi基因检测中的应用。

有益效果

标记sacmi1100能够明显区分喀西茄抗根结线虫病基因sacmi和栽培品种中的mi同源基因，可以在苗期对喀西茄与栽培茄的种间杂交后代群体进行抗根结线虫病基因sacmi的快速检测，提高育种效率。

四、附图说明

图1喀西茄与苏州牛角、徐州长茄、七叶茄的pcr检测结果

图2sami02f与sami02r引物组合的pcr检测结果，其中m为dna分子量标准，1-24依次为喀西茄、喀西茄×苏州牛角(f1)、成都墨茄、短把黑、二民茄、杭州红茄、济南六叶茄、宁波藤茄、潘茄、平湖小茄、七叶茄、三月茄、苏州牛角、芜湖白茄、西安绿茄、小黄茄、一口茄、徐州长茄、扬州长茄、大圆茄、面条茄、徐州早圆茄、马路茄、蚌埠青长茄。其中喀西茄引自荷兰种质资源库，其余栽培茄材料引自国家种质资源中期库。

五、具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1)引物设计

播种喀西茄的种子，待幼苗长至4片真叶期时，取面积约1cm²的细嫩叶片，采用ctab法提取dna，dna浓度调整为50ng/ul。

根据喀西茄sacmi基因的全长核苷酸cdna序列及其与番茄、辣椒抗根结线虫基因同源序列间的差异，设计引物：

上游引物sami02f为5’-cagcgaagtggaagtgatga-3’，

下游引物sami02r为5’-gcaaagtgaaccaagtgcaa-3’，产物大小1107bp。

2)pcr扩增和产物检测

采用20ul的反应体系，包括2×taqmix(上海浦迪生物技术公司)10ul，引物sami02f(10pmol/l)0.5ul，引物sami02r(10pmol/l)0.5ul，dna50ng。pcr程序参数为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸7min。pcr产物中加入加样缓冲液，取10ul点样于1.5％的含eb的琼脂糖凝胶中，100v电压下电泳1小时，利用凝胶成像系统拍照(图1)。对喀西茄和3个栽培茄品种包括苏州牛角、徐州长茄和七叶茄进行扩增。结果发现，引物组合sami02f和sami02r仅在喀西茄中扩增出清晰的1100bp左右的条带，而在另外3个栽培茄材料中无明显扩增，说明该引物组合可以特异性地检测喀西茄抗根结线虫病基因sacmi。根据扩增产物的大小，将该标记命名为sacmi1100。

3)分子标记验证

进一步以喀西茄、喀西茄×苏州牛角(f1)和22个公知公用栽培品种(成都墨茄、短把黑、二民茄、杭州红茄、济南六叶茄、宁波藤茄、潘茄、平湖小茄、七叶茄、三月茄、苏州牛角、芜湖白茄、西安绿茄、小黄茄、一口茄、徐州长茄、扬州长茄、大圆茄、面条茄、徐州早圆茄、马路茄、蚌埠青长茄)为材料，利用引物组合sami02f和sami02r进行pcr检测(图2)。结果表明，引物组合sami02f和sami02r仅在喀西茄和喀西茄×苏州牛角(f1)两份材料中有明显的扩增产物，而在其它材料中则没有明显扩增，说明该引物组合可以特异性区分喀西茄和感病茄子品种，同时也能从喀西茄×苏州牛角(f1)中检测出喀西茄抗根结线虫基因sacmi。

seqidno：1：

agaattaagttatgaccatttaccagatcaagtgaagccatgcttgctttaccttgcaagttatccaaaggatactgctttgttaacctttatgttgatagattttttgcatcctgaaggacttgtcaagcagacacagatgaagagtgcggaagaagtgatgaaggtttatttggataacttagtttccagtagcttggtaattcttttcaatgagacttgccaacttcatgatcttgtgcatgacttttgtttgattaaagcaacaaaggaaaagttgtttggccgaataagttcaattgctccatcttcttcttcttcagatttgatgccacgtatagtgaccattgattataacagcgagttctttgggcttaacaatttcttcctgttcaattcaaataagaaaaggcattcgggtaaacacctgtattctttgtgtataaccggagacgacttggacgactctctttctgatacatttcacccaagacacttgaggcttcttagagtgttgaaactggatgcctctcttttcatggtgaaagattctttgctgagtgaaatatgcatgttgaatcatttgaggtacttacagattgcgacaaaagttaaatctctgcctgcttctttctcaaacctttggaatctagaaaccctagtggtggaaaattttggaacaaccttgatggtactattaccgagaatttggggtcttgtaaagttgcgaatgttgcttatagatcaatgttgtttctttgatttggatgcagatgaatcaatacttatagcagaggacacaaagttagagaagttgagaatttttcaggcacccgtgctttcctattcgaaaggcacagaggatattttcaaaaggtttcctaatcttcaaaatcttgtatttgttctcaaggaatcatcaacagaacaacattggttcccaaaattggatttcctaactcaactagaacatctcggtgtagaatttgaaagacacagtgggttctctgcagcgacaaattggtcgtgggattttcatttccctttgagtttgaaagaattgcacttggttcactttgctcttacatcggatgcactatcaacaat

seqidno：2：sami02f

cagcgaagtggaagtgatga

seqidno：3：sami02r

gcaaagtgaaccaagtgcaa。

sequencelisting

<110>江苏省农业科学院

<120>检测喀西茄抗根结线虫病sacmi基因的分子标记及引物和应用

<130>说明书

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1107

<212>dna

<213>喀西茄

<220>

<221>特异性标记sacmi1100

<222>(1)..(20)

<400>1

agaattaagttatgaccatttaccagatcaagtgaagccatgcttgctttaccttgcaag60

ttatccaaaggatactgctttgttaacctttatgttgatagattttttgcatcctgaagg120

acttgtcaagcagacacagatgaagagtgcggaagaagtgatgaaggtttatttggataa180

cttagtttccagtagcttggtaattcttttcaatgagacttgccaacttcatgatcttgt240

gcatgacttttgtttgattaaagcaacaaaggaaaagttgtttggccgaataagttcaat300

tgctccatcttcttcttcttcagatttgatgccacgtatagtgaccattgattataacag360

cgagttctttgggcttaacaatttcttcctgttcaattcaaataagaaaaggcattcggg420

taaacacctgtattctttgtgtataaccggagacgacttggacgactctctttctgatac480

atttcacccaagacacttgaggcttcttagagtgttgaaactggatgcctctcttttcat540

ggtgaaagattctttgctgagtgaaatatgcatgttgaatcatttgaggtacttacagat600

tgcgacaaaagttaaatctctgcctgcttctttctcaaacctttggaatctagaaaccct660

agtggtggaaaattttggaacaaccttgatggtactattaccgagaatttggggtcttgt720

aaagttgcgaatgttgcttatagatcaatgttgtttctttgatttggatgcagatgaatc780

aatacttatagcagaggacacaaagttagagaagttgagaatttttcaggcacccgtgct840

ttcctattcgaaaggcacagaggatattttcaaaaggtttcctaatcttcaaaatcttgt900

atttgttctcaaggaatcatcaacagaacaacattggttcccaaaattggatttcctaac960

tcaactagaacatctcggtgtagaatttgaaagacacagtgggttctctgcagcgacaaa1020

ttggtcgtgggattttcatttccctttgagtttgaaagaattgcacttggttcactttgc1080

tcttacatcggatgcactatcaacaat1107

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>

<220>

<221>sami02f

<222>(1)..(20)

<400>2

cagcgaagtggaagtgatga20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>

<220>

<221>sami02r

<222>(1)..(20)

<400>3

gcaaagtgaaccaagtgcaa20