本发明属生物核酸检测领域，特别是涉及一种两次bio-bar-code核酸检测技术。
背景技术：
核酸检测技术，可以分为两类，一是依赖酶促反应，包括基于聚合酶链式反应(PCR)的各种指数扩增技术、基于连接酶的线性扩增技术和基于特殊结构特异性内切酶的侵入法；二是非依赖酶促反应，主要通过杂交固定靶序列进行检测。
第一类核酸检测技术能对靶序列进行扩增，但是由于酶的储存运输要求严格，并且通常需要专业人员的操作，而且操作繁琐，耗时较长，价格相对昂贵，自动化存在困难。
如果采用杂交的方法，由于对靶序列没有前期的扩增，相对的检测灵敏度远不如酶促反应的检测方法，但操作比较简便，易于满足在各种复杂场地的检测需要。
纳米金最初应用于蛋白质的检测。由于纳米金颗粒在聚集的过程中会产生光学性质的变化，颜色由红变蓝，因此标记了核酸探针的纳米金颗粒可以通过杂交的方法检测溶液中的核酸(Science，1997)。
随着标记技术和染色技术的成熟，纳米金标记探针主要有两个方向：一是在标记了纳米金的探针上再标记荧光分子，在实现杂交分离后，可直接用于检测；二是标记了纳米金的探针在杂交分离后，再在芯片上进行杂交并用银染显色。前一种方法操作简便快速，但是由于没有放大的过程，检测的灵敏度有限，后一种方法由于有银染的放大过程，而且使用生物芯片的杂交方法，信号比较集中，使得其的检测灵敏度达到10-15mol，接近PCR地检测灵敏度，但是操作繁琐，条件严格，耗时较长。
开始于2004年的bio-bar-code扩增(BCA)技术则试图解决上述问题，达到快速灵敏检测的目的，整个体系包括磁珠、纳米金和五种探针。磁珠上标记一种和待测靶序列部分互补的探针，纳米金上共标记两种探针，一种是和待测靶序列另外一端部分互补的探针，另一种是用于信号放大的探针，这两组探针在纳米金表面的比例是1∶100，并且第二种探针还带有一段完全互补的DNA片段，作为检测的放大信号。在杂交的过程中，通过靶序列将两种纳米颗粒连接起来，通过磁分离器将杂交的纳米金探针吸附和纯化，再将用于检测的放大信号释放出来，通过相应的分子手段(如生物芯片)进行检测。这种方法主要的优势是采用了对待测靶序列进行了非酶促的信号放大反应。
BCA技术拥有两类核酸检测技术的优点，整个操作过程只有杂交、分离、洗涤和洗脱，以及最后的荧光检测。通过纳米金的表面标记探针，不依赖与酶促反应，同时对靶序列进行有效的扩增。整个操作可以在离心管中完成，分离纯化也基于纳米磁珠的磁分离原理，整个操作过程可以实现完全的自动化，并且由于不存在生物活性大分子的保存问题，可以广泛用于各种场所，如偏远地区、现场血样筛查、战场等。
2005年，Mirkin等继续对BCA技术做了近一步的研究改进，将使用的探针减少到两种，一种标记在磁珠上与靶序列部分互补，另一种标记在纳米金上与靶序列另一端部分互补。标记在纳米金上的探针在完成杂交、分离、洗涤后，可用洗脱液从纳米金探针的表面上洗脱下来。由于直径在30nm的纳米金颗粒，表面平均可以标记200～300个探针分子，因而洗脱下来的探针可以作为放大的信号用于分子检测，检测方式可以是同时标记了荧光的检测，或者用于芯片的进一步放大信号检测。根据检测手段的不同，整个操作时间分别在3个小时和6个小时以内。据文献报道，BCA技术的最短检测时间为3小时，但是迄今为止，快速的检测方法和利用毛细管电泳对BCA的信号探针进行快速高灵敏的检测未有报道。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种两次bio-bar-code核酸检测技术，该方法操作简单，特异性和灵敏度较高，易于自动化，有广泛的应用前景。
本发明的一种两次bio-bar-code核酸检测技术，包括如下步骤：
(1)磁珠探针、待测DNA和第一组纳米金探针混合，杂交；
(2)分离磁珠，洗涤，加洗脱液，继续保温杂交，磁分离，洗涤；
(3)重新悬浮沉淀，加入第二组纳米金探针，混合，杂交；
(4)分离磁珠，洗涤，加洗脱液，去磁珠，检测上清液。
所述的磁珠颗粒大小是0.5～1.5μm；
所述的纳米金颗粒是30nm；
所述的待测DNA浓度是10fm-100pm；
所述的磁珠探针是指一端为生物素修饰，一端为非生物素修饰的探针，长度为30～50个碱基；
所述的第一组纳米金探针是指一端为巯基修饰，一端为非巯基修饰的探针；
所述的第二组纳米金探针是指一端为巯基修饰，一端为荧光修饰的探针；
所述的杂交温度是30-55℃，优选55℃，杂交时间是5-60分钟，优选15分钟。
本发明使用的磁珠探针长度为30～50个碱基，分为两个部分，生物素修饰的一端与磁珠连接，这部分序列为随机序列，不与其它探针以及待检的靶序列互补，非生物素修饰的一端与待检的靶序列的一端互补。纳米金探针共有两组，第一组纳米金探针的一端为巯基修饰，该部分碱基能与磁珠的非生物素修饰端互补，而非巯基修饰端则与待检靶序列互补。第二组纳米金探针一端为巯基修饰，一端为荧光修饰，巯基修饰端为随机序列，不与其它探针以及待检的靶序列互补，而荧光修饰端与第一组探针的非巯基修饰端互补。
本发明的有益效果：(1)不依赖酶促反应，将靶序列扩增104～105倍，扩增效率接近PCR反应，并且由于不需要生物活性大分子的参与，试剂的运输保存相对容易；(2)由于纳米金探针本身的杂交特性，该法比一般的杂交方法特异性要高，背景相对较低；(3)整个操作简单，无需要专业人员的参与，易于实现自动化检测。
附图说明
图1是两次BCA技术检测核酸的示意图。
M为磁珠，N为纳米金，1为磁珠探针，2为待测核酸，3为第一组纳米金探针，4为第二组纳米金探针，并带有荧光标记。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
将一端为生物素修饰的磁珠(0.5～1.5μm)探针(30～50个碱基)、一端为巯基修饰的纳米金(30nm)探针与样本HBV病毒DNA混合，55℃杂交15分钟，用磁分离器迅速处理，用洗涤液洗涤4～5次，加入洗脱液，反应5～10分钟，继续保温杂交20～30分钟，用磁分离器处理，洗涤多次，加入第二组一端为巯基修饰另一端为荧光修饰的纳米金探针，55℃杂交15分钟，用磁分离器迅速处理，用洗涤液洗涤4～5次，加入洗脱液，反应5～10分钟，用磁分离器处理，去除磁珠，检测上清液。