本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种快速检测和定量干腌火腿加工过程中蛋白酶活性的方法。
背景技术：
传统干腌火腿是最重要的肉制品之一，经过长时间的加工过程，内部发生了大量物理化学和生物化学反应，使其成为风味独特的产品。蛋白质是传统干腌火腿的最主要化学成分，它的变化直接影响干腌火腿的品质。衡量干腌火腿品质的一个重要指标就是风味。干腌火腿在生产加工过程中，发生了缓慢的脂类和蛋白质降解，并分别导致火腿中游离脂肪酸和游离氨基酸堆积，上述两类化合物进一步反应生成了挥发性和水溶性风味物质。在传统干腌火腿加工中发生了显著的蛋白质降解，并且导致非蛋白氮、低分子量的蛋白质和多肽、游离氨基酸含量逐渐上升，这些含氮化合物或直接作为火腿风味物质或作为风味物质前体，从而形成干腌火腿的独特风味。随着肉制品加工工艺的不断改进和发展，人们对肉制品的消费结构也发生了变化，消费者越来越关注肉制品的独特风味。因此，开展干腌火腿生产加工过程蛋白质降解过程的研究对于其工业化发展具有重大的意义。
蛋白质降解反应能产生多种风味物质，蛋白质的降解物对干腌火腿的色泽、风味有重要影响，是干腌火腿制品主要的风味前体物质，对于干腌火腿特殊风味的形成有不可替代的作用。干腌火腿在腌制加工过程中，由于肉在成熟过程中蛋白质受组织蛋白酶的作用，肌肉中的蛋白质都发生不同程度的降解，生成小分子可溶性蛋白质、分子质量不等的游离氨基酸和多肽类物质，氨肽酶再作用于这些肽类物质，进而形成游离氨基酸，游离的氨基酸含量有所增加，如：新鲜肉中酪氨酸和苯丙氨酸等很少，而成熟后的浸出物中有酪氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸等存在。干腌火腿中含量较高的游离氨基酸包括谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸都是构成干腌火腿的重要风味物质，而色氨酸、蛋氨酸、天冬氨酸等游离氨基酸与干腌火腿的风味密切相关，这些氨基酸都具有增强肉的滋味和香气的作用，是构成干腌火腿的重要风味成分，使成熟后的肉类的风味提高，在质变化过程中发挥着十分重要的作用。除此之外，一些游离氨基酸会发生进一步的降解过程，发生脱羧、脱氨及参与美拉德反应，产生醛类和酮类等化合物，这些挥发性的风味物质也是干腌火腿香味物质的重要来源，与干腌火腿在成熟过程中的特殊风味的形成有密切联系。
肌肉组织中有微生物生长所分泌的外源蛋白酶，也有其本身就含有的肌肉内源蛋白酶。由于火腿内部微生物数量很低，在火腿加工过程中不可能对蛋白质水解起很大作用。肌肉内源蛋白酶是引起干腌火腿蛋白质降解的主要蛋白酶，酶加速了干腌火腿的腌制过程，在干腌火腿的特征风味和质构形成过程中起关键作用。内源蛋白酶的种类很多，但是对蛋白质降解发挥起主要作用的是组织蛋白酶。组织蛋白酶在牲畜被屠宰后活性变强，能够促进蛋白质反应，生成多肽化合物，进而生成游离氨基酸和挥发性羰基化合物这些腌肉制品中较重要的风味物质。组织蛋白酶是存在于肌浆中溶酶体内的一种酸性酶类，目前已经从肌肉中分离鉴定出近20 种组织蛋白酶，其中对蛋白质降解有重要影响的是组织蛋白酶B和L，被认为在肌肉蛋白质的宰后降解中起着重要作用。组织蛋白酶B和L同属于半胱氨酸蛋白酶，组织蛋白酶B和L的最适pH值都位于3.0～6.0之间。在pH值5时，组织蛋白酶B对肌动蛋白的降解起重要的作用，它对肌动蛋白起广泛降解作用，能够水解肌球蛋白、肌钙蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白，产生的大部分肽类是从蛋白质的N2端和C2端释放的，而且多数为水溶性多肽，对干腌肉制品的风味具有重要贡献；组织蛋白酶L能够降解肌球蛋白重链、α肌动素、肌动蛋白、肌钙蛋白的T亚基和I亚基。
在干腌火腿的整个加工过程中，都能检测到蛋白酶活性，并且蛋白酶的活性与小肽的生成数量及火腿的感官特征高度相关，蛋白酶促反应在干腌火腿的特征风味和质构形成过程中起着重要作用。在干腌火腿加工机制方面，组织蛋白酶属于内源蛋白酶中的一类，在干腌火腿加工全过程中都具有活性，并且在加工结束时仍保持5%～15%的活性，因此，组织蛋白酶被认为是引起干腌火腿中蛋白质降解和风味物质形成的主要蛋白酶类。蛋白质分解是干腌火腿工艺过程中重要的生化反应过程，在干腌火腿加工过程中，组织蛋白酶的活性也受多种因素的影响，a:原料种类:包括猪的年龄和品种的不同，这种差异是造成组织蛋白酶B和L不同的重要原因之一，例如组织蛋白酶B和L的活性随年龄增长而下降；轻型猪腿(7～8月龄)中的组织蛋白酶活性高于重型猪(11月龄)；b:原料肉的理化性质:即使是同一批鲜腿，肌肉理化性质的不同会导致其组织蛋白酶B和L的活性产生很大差异；c:腌制剂组成的不同，腌制过程中食盐用量多对组织蛋白酶B和L活性也有明显抑制作用。通常在火腿加工过程中提高食盐用量，使组织蛋白酶B活性下降，避免因组织蛋白酶B活性过大而引起的火腿质量缺陷；d:加工工艺的差别，会导致组织蛋白酶B和L的活性产生很大差异，例如环境温度、湿度和火腿的水分活度也会影响组织蛋白酶的活性。在加工过程中，火腿中水分活度不断下降，组织蛋白酶B和L的活性下降；成熟温度升高，组织蛋白酶B活性增强，火腿中非蛋白氮的形成量显著增加。以上因素的任何改变都可能影响火腿的成品质量。对干腌火腿加工的不同阶段的调查表明，组织蛋白酶B和L在加工全过程中都有活性，组织蛋白酶B和L在加工开始阶段最为活跃，在加工结束时，组织蛋白酶B和L残留活性为开始时的5%～15%。
由于组织蛋白酶活性及其在火腿加工过程中的变化与火腿中的肽、游离氨基酸及一些挥发性风味物质的形成密切相关，因此组织蛋白酶活性是干腌火腿感官质量的决定因素，对形成火腿独特风味有着重要的影响。组织蛋白酶活性的高低，影响着最后所得产品蛋白质水解程度的高低。组织蛋白酶活性对火腿特征风味和质构的形成起着重要作用，特别是火腿的质量缺陷与肌肉蛋白质的水解失控有关。组织蛋白酶活性越高，或成熟温度过高，会导致生产干腌火腿的蛋白质水解过度，加工出的火腿容易出现感官质量缺陷，特别是组织蛋白酶B与火腿的质地过软或粥样口感缺陷有关。因为火腿在加工过程中，随着成熟阶段的温度升高，组织蛋白酶B和二肽酶的活性增大，火腿蛋白水解越严重，导致产生缺陷火腿（表现为到苦味、光泽度差粘性和辛辣味大）的数量增加，相反按照传统工艺生产的干腌火腿，由于酶活性较低，蛋白质降解速度比较缓慢，能生产出质量较高的成品。因此内源蛋白酶（组织蛋白酶B和L）活性对干腌火腿的质量具有决定性作用，组织蛋白酶B和L的残留活性是判断干腌火腿质构缺陷的可靠指标，由于鲜腿中的组织蛋白酶B和L活性波动很大，测定内源蛋白酶活力，监控干腌火腿加工各过程中的肌肉组织中的组织蛋白酶B和L的活性，对于实现预报和调控火腿的产品质量具有重要价值，因此有望通过测定这项指标而实现对火腿的产品质量进行快速预测。
由于组织蛋白酶的活性受鲜腿来源、腌制剂组成、成熟温度、加工时间等多种因素的影响，协调好这些因素与酶活性之间的关系，对确保干腌火腿的质量具有决定性作用。研究蛋白质降解机理的过程，不仅要研究蛋白质降解都生成了哪些风味物质，更要弄清具体影响蛋白质降解的各种因素，从而可以人为有效地控制火腿成熟过程。因为盐分、水分活度、温度和湿度对组织蛋白酶活性有重要影响，盐抑制了组织蛋白酶的活性，因此通常加过量的盐控制干腌火腿加工过程中蛋白质的水解。因此，从经济学的观点研究控制火腿中复杂的蛋白质降解系统对获得稳定、高质量的产品非常重要。
目前对干腌火腿加工过程中的各个阶段蛋白质降解的监控主要通过物理和化学分析的手段测定蛋白质降解产物，间接推测出组织蛋白酶在蛋白质降解过程中的活性：主要采用液相色谱、气相色谱-质谱联用(GC-MS)及固相微萃取(SPME)质谱等方法测定火腿中的挥发性风味物质；采用高效液相色谱法、反相高效液相色谱、游离溶液的毛细管电泳测定火腿加工过程的肽含氮化合物、羰基化合物、非蛋白氮、多肽含氮化合物、氨基酸态含氮物；采用SDS-PAGE对肌浆蛋白(水溶性蛋白)和肌原纤维蛋白进行电泳等。这些物理和化学分析手段耗时和耗力，而且非常过程复杂。
了解干腌火腿加工过程中蛋白酶的活性对蛋白质降解的作用规律，减少腌制时间，加快干腌火腿的成熟，降低生产成本，生产出风味更好的干腌火腿一直是我们面临的挑战，而其中的难点在于开发一种能快速检测和定量蛋白酶活性的方法，可直接用于监控干腌火腿加工过程中的蛋白质降解程度，保证干腌火腿的品质。目前用于快速检测和定量在干腌火腿加工过程中的组织蛋白酶活性的方法未开发出来。
本发明专利申请采用绿色荧光蛋白酶染色方法（Protease Fluorescent 染色）来标定和定量蛋白酶，不仅可以快速监控和定量干腌火腿加工过程中的蛋白酶的活性，监控火腿加工过程中复杂的蛋白质降解过程，而且可以根据蛋白酶的活性的高低，及时调整加工过程中的盐分、水分活度、温度和湿度条件，实现对干腌火腿品质调控，改善干腌火腿生产加工工艺，加快干腌火腿成熟，对于促进我国干腌火腿的工业化发展具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，，提供了一种快速检测和定量干腌火腿加工过程中蛋白酶的活性的方法（绿色荧光蛋白酶染色方法），而且可以根据测定的蛋白酶活性的高低，及时调整加工过程中的盐分、水分活度、温度和湿度条件，实现对干腌火腿品质调控，改善干腌火腿生产加工工艺，加快干腌火腿成熟，对于促进我国干腌火腿的工业化发展具有重要的现实意义。本发明方法与以前的物理化学方法比较，特点是快速，成本较低，操作简便，操作人员不需要特殊的培训，对检测的地点无特殊的要求，实验结果准确，能迅速提供给生产人员相关的数据。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种快速检测和定量干腌火腿加工过程中蛋白酶活性的方法，包括如下步骤：
步骤（1），明胶涂片的制作：将十二水硫酸钾铬和明胶加入水中，加热至68-72℃，待明胶全部溶解后将干净的无菌的三孔载玻片置于其中，保持温度，10-15分钟后，将三孔载玻片取出，自然干燥，得到明胶涂片；其中，十二水硫酸钾铬、明胶和水的质量比为（0.43-0.45）：（2.4-2.6）：3.5×103；
步骤（2），样品采集与稀释：在无菌条件下，将火腿切成粒径为2-4cm的碎块，备用；接着向火腿碎块中加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，混匀后，搅成肉泥；其中，火腿碎块与1×PBS缓冲液的质量体积比为1：（9-11）；
步骤（3），洗脱蛋白酶：将步骤（2）的得到的肉泥放入到无菌BioRad匀浆袋中，并加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，加入量为步骤（2）1×PBS缓冲液加入量的一半，匀浆后过滤，收集滤液；
步骤（4），收集蛋白酶：将步骤（3）收集到的滤液离心，弃沉淀后再次离心，取上清液，将上清液抽滤，之后将抽滤得到的滤液离心弃上清，向留下的物质中加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，直至总体积为步骤（2）1×PBS缓冲液加入体积的一半，得到细胞悬浮液，于4℃下储存，备用；
步骤（5），组织蛋白酶的活性测定：取步骤（4）得到的细胞悬浮液，向其中加入蛋白酶荧光检测试剂盒中的FITC标记的酪蛋白底物和培养缓冲液，并混合均匀，之后于37℃下，摇床培养0.9-1.1小时，之后向其中加入蛋白酶荧光检测试剂盒中的0.6 N三氯乙酸酸性溶液，混匀后，继续摇床培养20-30min，后离心，于无菌条件下将上清液涂布于步骤（1）制得的明胶涂片的三个孔中并风干；每孔的涂布厚度相同，皆为9.8-10.2µm；
细胞悬浮液、FITC标记的酪蛋白底物、培养缓冲液和0.6 N三氯乙酸酸性溶液的体积比为1：（1.9-2.1）：（1.9-2.1）：（1.45-1.55）；
步骤（5）的整个过程均保持在避光条件下操作；
步骤（6），显微镜观察与组织蛋白酶活性的确定：将步骤（5）风干的明胶涂片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，通过绿色荧光激发块观察绿色荧光，激发波长为485 nm，发射波长为535 nm；每个样品从每个孔的不同部位随机采集15-30张数据图片；之后采用图像分析软件Image J 分析测定采集的每一张数据图片的荧光强度，然后计算每个样品荧光强度的平均值，并根据荧光强度确定组织蛋白酶的活性。
进一步，优选的是，步骤（2）中，混合均匀后，以16000-18000r/min速度搅拌1.5-2.5分钟，然后以10000-13000r/min的速度搅碎1-3分钟，即得到肉泥。
进一步，优选的是，向步骤（3）得到的滤渣中再次加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，加入量为步骤（2）1×PBS缓冲液加入量的一半，混匀后，用搅拌机于16000-18000r/min的速度搅拌1-2min后转入无菌BioRad匀浆袋中匀浆，在BioRad匀浆器上以500-800r/min的速度匀浆10-15分钟，过滤，收集滤液；滤渣再次重复此过程，重复3-5次，合并所有滤液后，一起进入步骤（4）离心。
进一步，优选的是，步骤（4）中，将步骤（3）收集到的滤液离心的离心条件为4000-5000g，10-15min；弃沉淀后再次离心的离心条件为4000-5000g，10-15min；将抽滤得到的滤液离心的离心的条件为10000-13000g，10-15min。
进一步，优选的是，将抽滤得到的滤液离心弃上清的具体步骤可以是：将滤液分成若干等份，然后将其中一等份滤液离心弃上清后，再向其中加入第二等份滤液，再离心弃上清，以此类推，直至所有等份滤液均加入完，最后离心弃上清。
进一步，优选的是，步骤（5）所述的摇床培养的速度为100-150 r.p.m。
进一步，优选的是，步骤（5）所述的离心条件为10000-13000g，10-15min。
本发明的方法和原理如下：
（1）蛋白酶荧光染色法原理：
Sigma-Aldrich公司的Protease Fluorescent Detection Kit(蛋白酶荧光检测试剂盒)主要用于检测混合样品中的半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶的活性，本专利申请的创新之处在于把它用于检测混合样品如干腌火腿加工过程中肌肉的组织蛋白酶的活性。其原理为：由于干腌火腿加工过程中对肌肉蛋白质降解起主要作用的组织蛋白酶B和L都属于半胱氨酸蛋白酶，而蛋白酶荧光检测试剂盒提供了现成使用的试剂来检测蛋白酶活性的存在。这个简单的方法检测蛋白酶的活性使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的酪蛋白作为底物，蛋白酶活性的存在导致FITC标记的酪蛋白底物裂解成小的片段，在酸性条件下，这些片段并不能沉淀。当含有蛋白酶活性的样品和底物培养后，通过加入三氯乙酸（TCA）将反应酸化。将混合物离心后，没有裂解的底物形成较小的颗粒沉集在底部，裂解的底物小片段则保留在溶液的上清液中，通过测定上清液中FITC标记酪蛋白裂解的小片段的荧光强度，可以间接地反映出样品中蛋白酶的活性。对于干腌火腿样品，反映的主要是组织蛋白酶的活性。
（2）获得最佳的培养时间:
为了得到最优化的培养时间，以保证最大限度的观察组织蛋白酶的活性，我们以宣威当地含乌金猪血统的杂交猪后腿为原料(品种一致、日龄相似、腿重相近)，按传统加工工艺加工宣威火腿，火腿加工在宣威市宣拓食品集团有限公司进行。搜集股二头肌的腌制前 （0d）、腌制期（90d）、发酵初期（210d）、发酵中期（270d）、发酵末期（360d）这5个加工阶段随机取出5 条火腿，以股二头肌为中心取约100g 样品，然后真空包装，分析前-20℃保存，分别测试了5个样品的不同培养时间，从1小时开始，以后每隔1小时观察一次，直到24个小时。随着摇床培养时间的增加，所观察到的荧光强度非常缓慢地增加。经过用Image J软件分析和对比图片，培养1小时所取的样品，已经能观察到最佳的荧光信号。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明专利申请开发了一种从复杂系统干腌火腿加工过程中快速检测和定量蛋白酶活性的手段和方法，由于以前研究干腌火腿加工过程中蛋白酶的活性的方法都是利用物理和化学的分析手段，通过分别测定火腿加工过程中蛋白质降解物包括多肽含氮化合物、羰基化合物、非蛋白氮、氨基酸态含氮物的含量，从而间接推测出蛋白酶的活性。这些方法和手段耗时耗力，成本较高，样品前处理过程繁琐，操作过程复杂，特别是操作人员需要接受特殊的培训，才能掌握大型测定仪器的操作方法，完成对各种化合物的测定。本发明手段和以前的物理化学分析测定方法比较，特点是可以直接检测和定量蛋白酶的活性，缩短和降低了50%的劳动强度，无需繁琐的样品前处理过程，成本降低20-50%，操作过程简便，操作人员不需要特殊的培训，对检测地点无特殊的要求，实验结果准确无误，效率提高了50%，能迅速提供给生产人员相关的数据。
附图说明
图1是干腌火腿腌制的不同阶段对应蛋白酶相对的荧光强度图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明中所述的质量体积比的单位为g/mL。
本发明除非另有说明，否则百分号代表质量百分数。
实施例1
一种快速检测和定量干腌火腿加工过程中蛋白酶活性的方法，包括如下步骤：
步骤（1），明胶涂片的制作：将十二水硫酸钾铬和明胶加入水中，加热至68℃，待明胶全部溶解后将干净的无菌的三孔载玻片置于其中，保持温度，10分钟后，将三孔载玻片取出，自然干燥，得到明胶涂片；其中，十二水硫酸钾铬、明胶和水的质量比为0.43：2.4：3.5×103；
步骤（2），样品采集与稀释：在无菌条件下，将火腿切成粒径为2-4cm的碎块，备用；接着向火腿碎块中加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，混匀后，以16000r/min速度搅拌1.5分钟，然后以10000r/min的速度搅碎1分钟，得到肉泥；其中，火腿碎块与1×PBS缓冲液的质量体积比为1：9；
步骤（3），洗脱蛋白酶：将步骤（2）的得到的肉泥放入到无菌BioRad匀浆袋中，并加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，加入量为步骤（2）1×PBS缓冲液加入量的一半，匀浆后过滤，收集滤液；滤渣中则再次加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，加入量为步骤（2）1×PBS缓冲液加入量的一半，混匀后，用搅拌机于16000r/min的速度搅拌1min后转入无菌BioRad匀浆袋中匀浆，在BioRad匀浆器上以500r/min的速度匀浆10分钟，过滤，收集滤液；滤渣再次重复此过程，重复3次，合并所有滤液后，一起进入步骤（4）离心；
步骤（4），收集蛋白酶：将步骤（3）收集到的滤液离心，弃沉淀后再次离心，取上清液，将上清液抽滤，之后将抽滤得到的滤液离心弃上清，向留下的物质中加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，直至总体积为步骤（2）1×PBS缓冲液加入体积的一半，得到细胞悬浮液，于4℃下储存，备用；
其中，将步骤（3）收集到的滤液离心的离心条件为4000g，10min；弃沉淀后再次离心的离心条件为4000g，10min；将抽滤得到的滤液离心的离心的条件为10000g，15min。
步骤（5），组织蛋白酶的活性测定：取步骤（4）得到的细胞悬浮液，向其中加入蛋白酶荧光检测试剂盒中的FITC标记的酪蛋白底物和培养缓冲液，并混合均匀，之后于37℃下，摇床培养0.9小时，之后向其中加入蛋白酶荧光检测试剂盒中的0.6 N三氯乙酸酸性溶液，混匀后，继续摇床培养20min，后离心，于无菌条件下将上清液涂布于步骤（1）制得的明胶涂片的三个孔中并风干；每孔的涂布厚度相同，皆为9.8µm；
细胞悬浮液、FITC标记的酪蛋白底物、培养缓冲液和0.6 N三氯乙酸酸性溶液的体积比为1：1.9：1.9：1.45；
步骤（5）的整个过程均保持在避光条件下操作；摇床培养的速度为100r.p.m；离心条件为10000g，10min；
步骤（6），显微镜观察与组织蛋白酶活性的确定：将步骤（5）风干的明胶涂片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，通过绿色荧光激发块观察绿色荧光，激发波长为485 nm，发射波长为535 nm；每个样品从每个孔的不同部位随机采集15张数据图片；之后采用图像分析软件Image J 分析测定采集的每一张数据图片的荧光强度，然后计算每个样品荧光强度的平均值，并根据荧光强度确定组织蛋白酶的活性。
实施例2
一种快速检测和定量干腌火腿加工过程中蛋白酶活性的方法，包括如下步骤：
步骤（1），明胶涂片的制作：将十二水硫酸钾铬和明胶加入水中，加热至72℃，待明胶全部溶解后将干净的无菌的三孔载玻片置于其中，保持温度，15分钟后，将三孔载玻片取出，自然干燥，得到明胶涂片；其中，十二水硫酸钾铬、明胶和水的质量比为0.45： 2.6：3.5×103；
步骤（2），样品采集与稀释：在无菌条件下，将火腿切成粒径为2-4cm的碎块，备用；接着向火腿碎块中加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，混匀后，以18000r/min速度搅拌2.5分钟，然后以13000r/min的速度搅碎3分钟，得到肉泥；其中，火腿碎块与1×PBS缓冲液的质量体积比为1：11；
步骤（3），洗脱蛋白酶：将步骤（2）的得到的肉泥放入到无菌BioRad匀浆袋中，并加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，加入量为步骤（2）1×PBS缓冲液加入量的一半，匀浆后过滤，收集滤液；滤渣中则再次加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，加入量为步骤（2）1×PBS缓冲液加入量的一半，混匀后，用搅拌机于18000r/min的速度搅拌2min后转入无菌BioRad匀浆袋中匀浆，在BioRad匀浆器上以800r/min的速度匀浆15分钟，过滤，收集滤液；滤渣再次重复此过程，重复5次，合并所有滤液后，一起进入步骤（4）离心；
步骤（4），收集蛋白酶：将步骤（3）收集到的滤液离心，弃沉淀后再次离心，取上清液，将上清液抽滤，之后将抽滤得到的滤液离心弃上清，向留下的物质中加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，直至总体积为步骤（2）1×PBS缓冲液加入体积的一半，得到细胞悬浮液，于4℃下储存，备用；
其中，将步骤（3）收集到的滤液离心的离心条件为5000g， 15min；弃沉淀后再次离心的离心条件为5000g， 15min；将抽滤得到的滤液离心的离心的条件为13000g，10min。
步骤（5），组织蛋白酶的活性测定：取步骤（4）得到的细胞悬浮液，向其中加入蛋白酶荧光检测试剂盒中的FITC标记的酪蛋白底物和培养缓冲液，并混合均匀，之后于37℃下，摇床培养1.1小时，之后向其中加入蛋白酶荧光检测试剂盒中的0.6 N三氯乙酸酸性溶液，混匀后，继续摇床培养30min，后离心，于无菌条件下将上清液涂布于步骤（1）制得的明胶涂片的三个孔中并风干；每孔的涂布厚度相同，皆为10.2µm；
细胞悬浮液、FITC标记的酪蛋白底物、培养缓冲液和0.6 N三氯乙酸酸性溶液的体积比为1：2.1：2.1：1.55；
步骤（5）的整个过程均保持在避光条件下操作；摇床培养的速度为150 r.p.m；离心条件为13000g，15min；
步骤（6），显微镜观察与组织蛋白酶活性的确定：将步骤（5）风干的明胶涂片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，通过绿色荧光激发块观察绿色荧光，激发波长为485 nm，发射波长为535 nm；每个样品从每个孔的不同部位随机采集30张数据图片；之后采用图像分析软件Image J 分析测定采集的每一张数据图片的荧光强度，然后计算每个样品荧光强度的平均值，并根据荧光强度确定组织蛋白酶的活性。
将抽滤得到的滤液离心弃上清的具体步骤可以是：将滤液分成若干等份，然后将其中一等份滤液离心弃上清后，再向其中加入第二等份滤液，再离心弃上清，以此类推，直至所有等份滤液均加入完，最后离心弃上清。
实施例3
一种快速检测和定量干腌火腿加工过程中蛋白酶活性的方法，包括如下步骤：
步骤（1），明胶涂片的制作：将十二水硫酸钾铬和明胶加入水中，加热至70℃，待明胶全部溶解后将干净的无菌的三孔载玻片置于其中，保持温度，13分钟后，将三孔载玻片取出，自然干燥，得到明胶涂片；其中，十二水硫酸钾铬、明胶和水的质量比为0.44：2.5：3.5×103；
步骤（2），样品采集与稀释：在无菌条件下，将火腿切成粒径为2-4cm的碎块，备用；接着向火腿碎块中加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，混匀后，以17000r/min速度搅拌2分钟，然后以12000r/min的速度搅碎2分钟，得到肉泥；其中，火腿碎块与1×PBS缓冲液的质量体积比为1：10；
步骤（3），洗脱蛋白酶：将步骤（2）的得到的肉泥放入到无菌BioRad匀浆袋中，并加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，加入量为步骤（2）1×PBS缓冲液加入量的一半，匀浆后过滤，收集滤液；滤渣中则再次加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，加入量为步骤（2）1×PBS缓冲液加入量的一半，混匀后，用搅拌机于17000r/min的速度搅拌1.5min后转入无菌BioRad匀浆袋中匀浆，在BioRad匀浆器上以700r/min的速度匀浆13分钟，过滤，收集滤液；滤渣再次重复此过程，重复4次，合并所有滤液后，一起进入步骤（4）离心；
步骤（4），收集蛋白酶：将步骤（3）收集到的滤液离心，弃沉淀后再次离心，取上清液，将上清液抽滤，之后将抽滤得到的滤液离心弃上清，向留下的物质中加入灭过菌的pH为7.0的1×PBS缓冲液，直至总体积为步骤（2）1×PBS缓冲液加入体积的一半，得到细胞悬浮液，于4℃下储存，备用；
其中，将步骤（3）收集到的滤液离心的离心条件为4600g，12min；弃沉淀后再次离心的离心条件为4400g，13min；将抽滤得到的滤液离心的离心的条件为11000g，13min。
步骤（5），组织蛋白酶的活性测定：取步骤（4）得到的细胞悬浮液，向其中加入蛋白酶荧光检测试剂盒中的FITC标记的酪蛋白底物和培养缓冲液，并混合均匀，之后于37℃下，摇床培养1小时，之后向其中加入蛋白酶荧光检测试剂盒中的0.6 N三氯乙酸酸性溶液，混匀后，继续摇床培养25min，后离心，于无菌条件下将上清液涂布于步骤（1）制得的明胶涂片的三个孔中并风干；每孔的涂布厚度相同，皆为10µm；
细胞悬浮液、FITC标记的酪蛋白底物、培养缓冲液和0.6 N三氯乙酸酸性溶液的体积比为1：2：2：1.5；
步骤（5）的整个过程均保持在避光条件下操作；摇床培养的速度为120 r.p.m；离心条件为11500g，11min；
步骤（6），显微镜观察与组织蛋白酶活性的确定：将步骤（5）风干的明胶涂片置于荧光显微镜物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，通过绿色荧光激发块观察绿色荧光，激发波长为485 nm，发射波长为535 nm；每个样品从每个孔的不同部位随机采集20张数据图片；之后采用图像分析软件Image J 分析测定采集的每一张数据图片的荧光强度，然后计算每个样品荧光强度的平均值，并根据荧光强度确定组织蛋白酶的活性。
应用实例
本实例中将采用传统工艺生产的不同腌制时期宣威干腌火腿为样品测定蛋白酶的活性。我们以宣威当地含乌金猪血统的杂交猪后腿为原料(品种一致、日龄相似、腿重相近)，按传统加工工艺加工宣威火腿，火腿加工在宣威市宣拓食品集团有限公司进行。搜集股二头肌的腌制前 （0d）、腌制期（90d）、发酵初期（210d）、发酵中期（270d）、发酵末期（360d）这5 个加工阶段随机取出5 条火腿，以股二头肌为中心取约100 g 样品，然后真空包装，分析前-20℃保存。本实例分别测试了5个样品中的蛋白酶的相对的荧光强度（如图1），用蛋白酶相对的荧光强度表示的蛋白酶的活性和用化学分析手段和方法测定出来的结果基本相似，证明了此方法的可靠和有效性。
具体实验步骤如下：
1.实验试剂、仪器、设备
1.1 实验试剂
1×PBS缓冲液（pH 7.0)、培养缓冲液、FITC 标记的酪蛋白底物、0.6 N Trichloroacetic Acid Solution （0.6 N三氯乙酸酸性溶液）、蒸馏水、超纯水、无水乙醇、明胶、十二水硫酸铬钾，洗洁精；
1.2 实验仪器与设备
塑料砧板、菜刀、搅拌机、布氏漏斗、中性滤纸、盒装铝箔、三孔载玻片、载玻片架、载玻片盒、洗液瓶、试管架、移液枪、烧杯、匀质器、胶头滴管、煮锅、磁力震荡加热器，温度计、50ml离心管、2 mL eppendof离心管、BioRad匀浆袋、玻棒、广口瓶、莱卡DM6000B荧光显微镜、eppendof离心机、BioRad匀浆机、电子秤、旋转摇床；
1.3实验药品配制
标记的绿色荧光蛋白质染液： 配制的过程根据Protease Fluorescent Detection Kit (蛋白酶荧光检测试剂盒)［购自Sigma-Aldrich］中描述的方法进行；
1.4 制作明胶涂片
在载玻片上覆上一层明胶的方法的目的是让样品均匀地分散和固定在载玻片上，使得干腌火腿样品在染色过程中不会从载玻片上脱落。取7个载玻片架，将三孔载玻片填满于载玻片架中。用锅装3.5升蒸馏水，在水中加入4-5滴洗涤剂，放入载玻片架，煮沸约10分钟。10分钟后取出载玻片架，晾3分钟，然后用蒸馏水将洗涤剂冲洗干净，将三孔载玻片保持直立状态晾干。在另外一口锅中加入3.5升蒸馏水，在水中加入2.5g的十二水硫酸钾铬和0.44g的明胶，加热至70℃左右，待明胶基本溶解后放入载玻片架，煮大约10分钟，温度控制在70℃，10分钟后取出载玻片架，将三孔载玻片斜立于试管架边上，让它干燥，干燥后可以看到三孔载玻片上均匀的覆上一层透明薄膜状的明胶。
三孔载玻片购自于广州凯秀贸易有限公司。
2：实验过程:
2.1在无菌条件下进行收集干腌火腿中的总蛋白酶
（A）样品采集：
在实验室首先将塑料砧板和菜刀清洗，用70%酒精进行消毒，在无菌操作台紫外线照半小时后，将火腿放在塑料砧板上，并将火腿切成碎块，粒径为2-4cm，备用；
（B）稀释样品：
用无菌的150ml烧杯在电子秤上称取火腿碎块样品10g，然后加入灭菌后的100毫升1×PBS缓冲液（pH 7.0)，混匀；用75%酒精消过毒的搅拌机，将混匀的样品倒入搅拌机，以16000-18000r/min速度搅拌2分钟，然后启动慢档速度(10000-13000r/min)搅碎1-3分钟，直到看到碎肉搅成肉泥状为止；
（C）洗脱蛋白酶：
将混匀的肉泥从搅拌机转入到无菌BioRad 匀浆袋中，加入50ml 1×PBS缓冲液，在BioRad匀浆器高速档 (500-800r/min) 匀浆10分钟，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；将滤液倒入平铺了8层纱布的500ml烧杯中，并用玻璃棒进行辅助过滤，每次用纱布过滤时，用手将纱布的四角严密合拢挤压，使滤液快速通过；
将遗留在纱布中的大的残留火腿颗粒，重新倒入搅拌机中，加入50ml 1×PBS缓冲液，用高档速度（16000-18000r/min）搅碎1-2分钟，再倒入滤袋中在BioRad匀浆器高速档 (500-800r/min) 匀浆10分钟，通过匀浆袋侧边的过滤格过滤；将滤液倒入平铺了8层纱布的500ml烧杯中，此过程重复4次；
(D）收集滤液：将滤液收集在无菌的50ml离心管中，离心（4000-5000 g)10-15分钟；
(E）收集沉淀物（蛋白酶）：
1：离心结束，收集上清液，弃沉淀。将上清液分装在10ml的离心管中，每只离心管分装7ml，离心10-15分钟，速度保持在4000-5000 g；离心结束，收集上清液，弃沉淀。
2：首先用蒸馏水浸湿中性滤纸并贴于安装消毒过的布氏漏斗上，然后将上清液倒入布氏漏斗，启动抽滤；
3：抽滤过程中，如果发现液体不再滴漏，关闭抽滤装置，用移液枪吸出漏斗中未抽滤完的上清液，更换滤纸后继续进行抽滤；
4：待全部上清液抽滤结束后，吸1ml滤液进入无菌的1.5ml离心管，10000-13000g离心8-10 分钟，去除上清液，继续加入1ml抽滤液进入1.5ml离心管中，重复离心过程，直至所有抽滤液离心完为止；用1×PBS缓冲液（pH 7.0)重新悬浮所有1.5ml离心管中的沉淀物，并转移到10 ml 的试管中，加入 1×PBS缓冲液（pH 7.0)至总体积为5 ml为止，混匀待用。在等待下一步的实验过程中，可将细胞悬浮液 （5 ml）储存于4℃的冰箱中。
2.2蛋白酶荧光检测试剂盒测定干腌火腿加工过程中组织蛋白酶的活性
（A）取100μL细胞悬浮液样品 （从上一步中获得）转入到无菌的2 mL eppendof离心管中，加入200μL FITC 标记的酪蛋白底物和200μL 培养缓冲液，FITC 标记的酪蛋白底物和培养缓冲液都是蛋白酶荧光检测试剂盒提供的；
（B）迅速用铝箔包严避光，并轻柔地混匀混合物；
（C）将包裹好的2 mL eppendof离心管固定在旋转摇床上37℃摇动培养1小时，速度保持在100-150 r.p.m；
（D）随后加入150μL 0.6 N三氯乙酸（TCA）酸性溶液 (蛋白酶荧光检测试剂盒提供)进入2 mL eppendof离心管中，轻柔地混匀；
（E）将包裹好的2 mL eppendof离心管固定在旋转摇床上37℃摇动培养30分钟，速度保持在100-150 r.p.m；
（F）离心2 mL eppendof离心管10分钟，速度保持在10000-13000g，然后将2 mL eppendof离心管转移到无菌操作箱，打开离心管，吸取30 μL 上清液分别均匀涂布于用明胶涂层的三孔载玻片上（每孔的涂布厚度相同，均为10µm，即每个孔中加入10µL上清液均匀涂布），并在无菌操作箱中风干20分钟，整个过程需要避光。
2.3 显微镜观察
将干燥好的三孔载玻片置于荧光显微镜（莱卡DM6000B，配备莱卡DFC500数字照相机）物镜台上100×的物镜下进行观察和拍照，通过绿色荧光激发块观察绿色荧光。每个样品从每个孔的不同位置随机采集30张数据图片，共90张数据图片。
2.4 干腌火腿加工过程中组织蛋白酶的活性的确定
采用莱卡DM6000B荧光显微镜获取荧光图像，激发波长为485 nm，发射波长为535 nm，采集荧光图像为绿色。采集样品的荧光图片时，所有的图片采用相同的仪器参数储存。随后，采用图像分析软件Image J 分析测定采集的每一张荧光图片的荧光强度。每个样品包括重复测定的90张数据图片，获得的数据用来分析干腌火腿中组织蛋白酶的荧光强度，然后计算出平均值，结果如图1所示。
2.5统计分析
t检验和方差分析均在excel中完成。
方差分析结果已经表示在图1中；T检验的结果p值表明没有显著差异。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。