本发明涉及微生物发酵领域，具体地涉及一种复合菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法。
背景技术：
香兰素(Vanillin)，又名香草醛、香兰醛等，是香荚兰豆中的主要成分，化学名为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，相对分子量为152.15。香兰素外观为白色至微黄色针状结晶或粉末，呈香荚兰豆特有的香气，微甜，在潮湿的空气中缓慢氧化为香兰酸。
香兰素是世界上产量最大、用途最广的香料之一，被誉为“香料之王”，广泛应用于巧克力、冰淇淋、糖果等食品以及香烟、饮料和高档化妆品中。它不仅可以用作增香剂和定香剂，还在食品中用作防腐剂、保鲜剂和抗氧化剂。香兰素的世界年消费量约1.2万吨，而天然香兰素的产量仅为1800吨，因此远不能满足需求。
目前常用的香兰素生产方法有植物原料提取法和化学合成法。香兰素在香荚兰豆中含量约为15-20g/kg。香荚兰种植受地域和气候环境的限制产量极少，且在种植过程中需要对花朵进行人工授粉、劳动强度大，难以进行大规模栽种，远远不能满足市场的需求。目前市场上绝大多数的香兰素产品是通过化学合成的，常用合成底物包括丁香酚、木质素、乙醛酸和愈创木酚等。国内常用的是采用愈创木酚和乌洛托品反应的亚硝化工艺，该方法路长，分离过程复杂，收率低，环境污染严重，原料消耗高，国外早已被淘汰。国外主要采用愈创木酚和乙醛酸缩合工艺，该工艺设备简单，产物纯度高，原料来源广泛，但是存在严重的缺陷，比如环境污染严重，产品香气单一，易掺杂质，合成香兰素的安全性也受到质疑。
香兰素的生物合成方法主要有微生物发酵、酶工程、细胞工程等，与化学合成相比，生物法合成香兰素具有反应条件温和，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，环境污染低，产品安全可靠等优点。但是综合考虑技术可行性、经济性、安全性等因素，微生物发酵法被认为是目前最实际的天然香兰素制取方法。许多天然物质如阿魏酸、1,2-二苯乙烯酚、丁香酚、木质素、异丁香酚等都可以作为生物转化生产香兰素的前体物质。
关于用多种微生物发酵法将阿魏酸转化为香兰素已有报道。如1996年Rabenhorst报道Streptomyces setonii ATCC39116和1998年A.Muheim报道的Amycolatopsis sp.HR167，香兰素浓度分别达到12g/L和11.5g/L，且培养基成分较为复杂，生产成本较高，副产物较多包括香兰酸、香兰醇和愈创木酚等，给产品分离提取带来了相当的困难。
技术实现要素：
本发明提供了一种复合菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法。该方法提取步骤简单，生产清洁，产品环境友好，安全可靠。
为了实现上述目的，提供了一种复合菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素的方法，包括以下步骤：
1)植生拉乌尔菌菌种活化：将植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)VP4-4，保藏编号：CCTCC NO:M 2012005接种到植生拉乌尔菌斜面培养基上，在25～38℃，静置培养24～72h后得到活化菌种，置于冰箱中；
2)制备植生拉乌尔菌种子培养液：将步骤1)中所得的活化菌种，接种到植生拉乌尔菌种子培养基，在25～38℃条件下，100～150r/min振荡培养24h～72h，连续转接1～3次，制得植生拉乌尔菌种子培养液；
3)食甲醇芽孢杆菌斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)VJ4-1，保藏编号：CCTCC NO:M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25～35℃、pH5～9条件下，静置培养24～72h；
4)制备食甲醇芽孢杆菌种子培养液：用步骤3)所得的斜面培养物，接种到食甲醇芽孢杆菌种子培养基，在25～35℃条件下，100～150rpm振荡培养24h～72h，连续转接1～4次，制得食甲醇芽孢杆菌种子培养液；
5)将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶1～3混合，得到复合菌液；
6)按重量份数比称取40～80份的蜂王浆、20～40份的灰树花提取液和5～20份的荔枝核提取液、5～10份的麦芽糊精和1～5份的蔗糖，混合得到发酵培养基；
7)按体积百分比1～5％的接种量将复合菌液接入发酵培养基中，在30～40℃条件下，100～200rpm振荡培养24～72h；得到发酵液；
8)向每升的发酵液中加入6～10g的阿魏酸，在30～40℃条件下，100～200rpm避光振荡培养6～12天后停止，在5000～10000rpm条件下，10～15min离心得到天然香兰素发酵液。
作为优选方案，所述步骤1)中，所述植生拉乌尔菌斜面培养基为：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L。
作为优选方案，所述步骤2)中，所述植生拉乌尔菌种子液培养基组成为：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L。
作为优选方案，所述步骤3)中，马铃薯葡萄糖斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
作为优选方案，所述步骤4)中，食甲醇芽孢杆菌种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
作为优选方案，所述步骤6)中，发酵培养基的原料按重量份数比由称取50～70份的蜂王浆、25～35份的灰树花提取液和8～15份的荔枝核提取液、6～9份的麦芽糊精和2～4份的蔗糖组成。
作为优选方案，所述步骤6)中，发酵培养基的原料按重量份数比由称取60份的蜂王浆、30份的灰树花提取液和10份的荔枝核提取液、8份的麦芽糊精和3份的蔗糖组成。
上述食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2012004，其生物学特征是：是革兰氏阳性菌，能在10％NaCl中生长，有精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶活性，能产酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水杨素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸盐、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸组氨酸、柠檬酸盐为碳源的培养基上生长，其16S rRNA序列与Bacillus methylotrophicus的16S rRNA序列比对相似性达到100％。
上述植生拉乌尔菌，该菌株名为Raoultella planticola VP4-4，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2012005，植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4，保藏编号：CCTCC NO:M 2012005的生物学特征是：革兰氏阴性菌，能产酸、使牛奶液化并生成吲哚产生、赖氨酸脱羧酶实验呈阳性；鸟氨酸脱羧酶实验、H2S产生、明胶液化呈阴性；能以单糖，多糖、酯类和氨基酸为唯一碳源生长，
植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4的分子鉴定特征为：其16SrRNA序列全长1408bp，16S rRNA序列与Raoultella planticola的相似度达到99.563％。
本发明的优点是：食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1 CCTCC NO:M 2012004和植生拉乌尔菌共同作用，生物转化阿魏酸生产天然香兰素，产量较高，方法工艺过程简单，反应条件温和，环境污染小，产物浓度较高，提取步骤简单，生产清洁，产品环境友好，安全可靠；本发明以蜂王浆、灰树花提取液和荔枝核提取液、麦芽糊精和蔗糖组成的发酵混合提取液作为碳源、氮源、以及底物，其生产天然香兰素具有天然环保无害优点。
具体实施方式
下面列举一部分实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述，有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
一种复合菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素1的方法，包括以下步骤：
1)植生拉乌尔菌菌种活化：将植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4，保藏编号CCTCC NO:M 2012005接种到植生拉乌尔菌斜面培养基上，在38℃，静置培养24h后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；其中，植生拉乌尔菌斜面培养基为：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L
2)制备植生拉乌尔菌种子培养液：将步骤1)中所得的活化菌种，接种到植生拉乌尔菌种子培养基，在25℃条件下，100r/min振荡培养72h，连续转接3次，制得植生拉乌尔菌种子培养液；其中，植生拉乌尔菌种子液培养基组成为：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L；
3)食甲醇芽孢杆菌斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1，保藏编号CCTCC NO:M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在30℃、pH7条件下，静置培养48h；其中，马铃薯葡萄糖斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
4)制备食甲醇芽孢杆菌种子培养液：用步骤3)所得的斜面培养物，接种到食甲醇芽孢杆菌种子培养基，在30℃条件下，100rpm振荡培养48h，连续转接2次，制得食甲醇芽孢杆菌种子培养液；其中，食甲醇芽孢杆菌种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
5)将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶1混合，得到复合菌液；
6)按重量份数比称取80份的蜂王浆、20份的灰树花提取液和20份的荔枝核提取液、5份的麦芽糊精和5份的蔗糖，混合得到发酵培养基；
7)按体积百分比5％的接种量将复合菌液接入发酵培养基中，在30～40℃条件下，100～200rpm振荡培养24～72h；得到发酵液；
8)向每升的发酵液中加入8g的阿魏酸，在40℃条件下，100rpm避光振荡培养8天后停止，在7000rpm条件下，12min离心得到天然香兰素发酵液1。
实施例2
一种复合菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素2的方法，包括以下步骤：
1)植生拉乌尔菌菌种活化：将植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4，保藏编号CCTCC NO:M 2012005接种到植生拉乌尔菌斜面培养基上，在30℃，静置培养72h后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；其中，植生拉乌尔菌斜面培养基为：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L；
2)制备植生拉乌尔菌种子培养液：将步骤2)中所得的活化菌种，接种到植生拉乌尔菌种子培养基，在32℃条件下，100r/min振荡培养48h，连续转接3次，制得植生拉乌尔菌种子培养液；其中植生拉乌尔菌种子液培养基组成为：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L；
3)食甲醇芽孢杆菌斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1，保藏编号CCTCC NO:M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25℃、pH9条件下，静置培养24h；其中，马铃薯葡萄糖斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
4)制备食甲醇芽孢杆菌种子培养液：用步骤3)所得的斜面培养物，接种到食甲醇芽孢杆菌种子培养基，在25℃条件下，100rpm振荡培养72h，连续转接4次，制得食甲醇芽孢杆菌种子培养液；其中，食甲醇芽孢杆菌种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
5)将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶3混合，得到复合菌液；
6)按重量份数比称取40份的蜂王浆、40份的灰树花提取液和5份的荔枝核提取液、10份的麦芽糊精和1份的蔗糖，混合得到发酵培养基；
7)按体积百分比5％的接种量将复合菌液接入发酵培养基中，在30℃条件下，200rpm振荡培养36h；得到发酵液；
8)向每升的发酵液中加入6g的阿魏酸，在30℃条件下，200rpm避光振荡培养6～12天后停止，在8000rpm条件下，12min离心得到天然香兰素发酵液2。
实施例3
一种复合菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素3的方法，包括以下步骤：
1)植生拉乌尔菌菌种活化：将植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4保藏编号CCTCC NO:M 2012005接种到斜面培养基上，在25℃，静置培养24h后得到活化菌种，置于冰箱中；其中，斜面培养基为：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L；
2)制备植生拉乌尔菌种子培养液：将步骤1)中所得的活化菌种，接种到种子培养基，在25℃条件下，100r/min振荡培养72h，连续转接1次，制得植生拉乌尔菌种子培养液；其中，植生拉乌尔菌种子液培养基组成为：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，氯化钠：5g/L；
3)食甲醇芽孢杆菌斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1，保藏编号CCTCC NO:M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在35℃、pH5条件下，静置培养24h；其中，马铃薯葡萄糖斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
4)制备食甲醇芽孢杆菌种子培养液：用步骤3)所得的斜面培养物，接种到食甲醇芽孢杆菌种子培养基，在35℃条件下，150rpm振荡培养24h，连续转接2次，制得食甲醇芽孢杆菌种子培养液；其中，食甲醇芽孢杆菌种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
5)将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶2混合，得到复合菌液；
6)按重量份数比称取60份的蜂王浆、30份的灰树花提取液和10份的荔枝核提取液、8份的麦芽糊精和3份的蔗糖，混合得到发酵培养基；
7)按体积百分比3％的接种量将复合菌液接入发酵培养基中，在35℃条件下，150rpm振荡培养48h；得到发酵液；
8)向每升的发酵液中加入8g的阿魏酸，在35℃条件下，150rpm避光振荡培养6～12天后停止，在8000rpm条件下，12min离心得到天然香兰素发酵液3。
实施例4
一种复合菌生物转化阿魏酸生产天然香兰素4的方法，包括以下步骤：
1)将植生拉乌尔菌Raoultella planticola VP4-4，保藏编号CCTCC NO:M 2012005接种到斜面培养基上，在30℃，静置培养48h后得到活化菌种，置于4℃冰箱中；其中，斜面培养基为：麦芽汁：120mL，蔗糖：20g/L，琼脂：15g/L；2)制备植生拉乌尔菌种子培养液：将步骤1)中所得的活化菌种，接种到植生拉乌尔菌种子培养基，在38℃条件下，150r/min振荡培养72h，连续转接2次，制得植生拉乌尔菌种子培养液；其中，种子液培养基组成为：麦芽糖：50g/L，蛋白胨：10g/L，
3)食甲醇芽孢杆菌斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1，保藏编号CCTCC NO:M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在30℃、pH6条件下，静置培养48h；其中，马铃薯葡萄糖斜面培养基：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
4)制备食甲醇芽孢杆菌种子培养液：用步骤5)所得的斜面培养物，接种到食甲醇芽孢杆菌种子培养基，在30℃条件下，120rpm振荡培养48h，连续转接3次，制得食甲醇芽孢杆菌种子培养液；其中，食甲醇芽孢杆菌种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
5)将植生拉乌尔菌种子培养液和食甲醇芽孢杆菌种子培养液按重量比1∶1混合，得到复合菌液；
6)按重量份数比称取50份的蜂王浆、30份的灰树花提取液和10份的荔枝核提取液、6份的麦芽糊精和3份的蔗糖，混合得到发酵培养基；
7)按体积百分比3％的接种量将复合菌液接入发酵培养基中，在35℃条件下，120rpm振荡培养24h；得到发酵液；
8)向每升的发酵液中加入6g的阿魏酸，在35℃条件下，120rpm避光振荡培养6～12天后停止，在10000rpm条件下，10min离心得到天然香兰素发酵液4。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。