本发明属于生物来源活性物质的制备，尤其涉及生物来源的活性物质的提取分离方法。
背景技术：
肽的消化吸收理论的进展证实了机体可直接吸收小分子肽类物质，肽类物质不但可以作为营养的有益补充，有些具有一定序列的肽还具有特殊的生理活性――即生物活性肽。来源于食物蛋白质中的小分子生物活性肽具有如下优势：分子质量小，易于消化吸收，不易引起免疫原性；空间构效关系简单，易于进行活性机理的研究；来源于食物蛋白质，不易引起毒副作用。
目前以食物蛋白质为原料，制备小分子肽的方法主要有：蛋白质的酸碱水解法、蛋白质的微生物发酵法、蛋白质的酶降解法。蛋白质的酸碱水解法方法简单，速度快，生产成本低廉，然而，其蛋白质水解度难于掌控，某些氨基酸易于被破坏，同时生产过程容易造成环境污染。蛋白质的微生物发酵法成本低廉，然而其生产时间过长，分离过程复杂，由于需要维持微生物生长，因此其蛋白质利用度大大下降。蛋白质的酶降解法，其水解程度易于掌控，酶解时间短，蛋白质利用度高，酶解产物易于分离，成本低廉；但纯肽产量较低，使得大规模的工业化生产受到一定的限制。而通过微生物发酵结合蛋白酶解的方法，可以在一定程度改善酶解产物的性状、产量，利于规模化生产。
近20年来，已有不少研究学者对牡蛎蛋白进行酶解，获取牡蛎寡肽，如抗HIV-1寡肽、抗氧化寡肽和ACE抑制寡肽。ACE是一种Zn-依赖型、胞外分泌的二肽羧肽酶，其可将Ang I转化为Ang II，Ang II与G-蛋白偶联受体ATR结合作用到靶细胞上，引起一系列升血压的过程。同时，ACE还能使一系列具有降血压作用的血管舒缓肽失活，引起机体血压的进一步升高。因此，ACE活性的抑制可有效的缓解高血压及其相关疾病。本发明人前期工作中，从牡蛎可溶性蛋白中分离得到ACE抑制肽(氨基酸序列为：VVYPWTORF)，IC50值为0.079mg/mL(66μmol/L)，经检测具有优异的ACE抑制活性，但从牡蛎中提取产率很低，严重影响了其应用设计及后续工作的开展。一直以来，我们致力于获得更多的天然来源的该短肽产物。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提高牡蛎来源ACE抑制肽(氨基酸序列为：VVYPWTORF)产量的方法，本发明的源于牡蛎的ACE抑制肽的制备方法，包括用胃蛋白酶对牡蛎蛋白进行酶解的步骤，其中所述的酶解时，体系中添加枯草芽孢杆菌和乳酸菌按照任意比例组成的复合菌剂。同等生产条件下，使用本法吗的方法能够有效大幅提高牡蛎来源的ACE抑制肽的产量，方法简单易行，易于推广并实现产业化应用。
附图说明
本发明附图1幅，即LH-20凝胶色谱对牡蛎酶解产物的分离结果图谱。
具体实施方式
本发明涉及一种源于牡蛎的ACE抑制肽，即氨基酸序列为VVYPWTORF活性短肽的制备方法。从牡蛎中制备具有ACE抑制活性的短肽，需要对牡蛎蛋白进行酶解。本发明也包括使用胃蛋白酶对牡蛎蛋白进行酶解的步骤，特征性地，本发明在酶解体系中添加枯草芽孢杆菌和乳酸菌按照任意比例组成的复合菌剂。
具体实施方式中，在复合菌剂的添加量方面，考察的结果显示，优选的复合菌剂的用量为牡蛎蛋白质量的0.4～0.6％。更优选0.5％。在复合菌剂的组成来看，由枯草芽孢杆菌和乳酸菌按照质量比1:1组成的复合菌剂对本发明的效果是最佳的。
另一具体实施方式中，对添加了复合菌剂的酶解过程参数进行考察，发现：单纯的酶解过程对过程参数的设计要求并不高，即各种可实施参数条件下的酶解结果无显著性差异。而添加了复合菌剂的酶解过程，便不单单是酶解过程，其中还包括了微生物发酵及作用的过程，对参数的变化更为敏感。考察结果发现，采用下述酶解过程/参数，能获得优选的结果：37±2℃条件下搅拌反应8～10h，之后体系于4±2℃静置8～10h，然后再于37℃搅拌反应6～8h。其中所述的搅拌过程可采用常规方法，例如但不限于低速磁力搅拌。
较为具体地，本发明所述的活性短肽的制备方法包括如下步骤：
(1)以新鲜牡蛎为原料制备牡蛎蛋白；
(2)将步骤(1)所制备的牡蛎蛋白按照2g/100ml的浓度加入至0.05mol/L的磷酸缓冲液中，并加入胃蛋白酶及复合菌剂，混合均匀后于37±2℃条件下搅拌反应8～10h，之后体系于4±2℃静置8～10h，然后再于37℃搅拌反应6～8h；
所述的胃蛋白酶的添加量为牡蛎蛋白质量的1.5％；
所述的复合菌剂的添加量为牡蛎蛋白质量的0.5％；
其中所述的磷酸缓冲液：0.05mol/L的NaH2PO4水溶液用1mol/L的HCl调pH值至2.0。
(3)从步骤(2)的反应完成的体系中分离纯化牡蛎ACE抑制肽。
其中，以新鲜牡蛎为原料制备牡蛎蛋白可以采用现有技术中已经记载的方法。本发明提供如下具体的步骤：将新鲜牡蛎脱壳后除去消化腺，剩余部分低温状态下(用匀浆机)绞碎后，加入到等体积的PBS缓冲液中，充分搅拌；混合物于4℃静置6小时后，离心取上清液，按照75wt％加入硫酸铵，再次在4℃条件下静置6小时，离心；然后将沉淀物与等体积水分散，装入透析袋，流水透析24小时，再用去离子水透析24小时，然后将内容物低压冷冻干燥，得到牡蛎蛋白。
其中所述PBS缓冲液：0.2mol/L的NaH2PO4溶液和0.2mol/L的Na2HPO4溶液按体积比39:61混合，pH 7.0。无特殊说明，该步骤中的离心操作均采用如下条件：5000×g，4℃，25min。
牡蛎蛋白经过上述发明步骤(2)，在蛋白酶和混合菌剂存在条件下酶解后，所得到的反应产物需进过分离纯化才是本发明目标的活性短肽。本发明具体采用如下分离纯化的步骤：步骤(2)的反应产物首先用Sephadex LH-20凝胶层析柱分离，流动相为30％的甲醇溶液，流速为0.5mL/min，上样体积为10mL，样品浓度为0.2g/mL，检测波长为280nm；台式纪录仪记录速度为0.2mm/min，电压10mv，电流2安培；以20min/管的速度收集25～30管组分；
采用RP-HPLC Hypersil BDS C18对产物进一步分离，上样体积20μl，上样浓度10mg/mL，流速1mL/min；
梯度洗脱：流动相A液：0.1％的TFA水溶液；流动相B液：乙腈；
0min：A，100％；B 0％；
40min：A，0％；B，100％；
50min：A，0％；B，100％；
检测波长为215nm；收集信号组分，监测并采集ACE抑制活性组分。
除非特殊说明，本发明中，采用茚三酮法方法检测蛋白水解度，用液相测定马尿酸含量的方法检测ACE抑制活性。
下述非限制性实施例用于对本发明做进一步说明，不应被理解为对本发明内容任意形式的限定。
实施例1
复合菌的加入方式对牡蛎酶解液ACE抑制活性影响
本实施例的试验方法及条件参数为E/S为1.5％的胃蛋白酶在pH2.0、37℃酶解牡蛎蛋白24h作为对照；实验组为E/S为1.5％的胃蛋白酶中加入0.5％的复合菌剂(枯草芽孢杆菌和乳酸菌,比例为1:1)，混合均匀后于37±2℃条件下搅拌反应8～10h，之后体系于4±2℃静置8～10h，然后再于37℃搅拌反应6～8h。
表1牡蛎蛋白质的水解度与ACE抑制活性
由表1可知，在胃蛋白酶酶解牡蛎蛋白时，其水解度为17.8％，ACE抑制活性为62％；而加入0.5％的复合菌后，酶解液的水解度提高为23％，ACE抑制活性提高为80％。
实施例2
具有ACE抑制活性肽的分离纯化
根据牡蛎ACE抑制肽的分离纯化方法，对牡蛎酶解液进行分离如图1所示，牡蛎酶解产物通过LH-20层析柱分离得到三个主要峰：组分I、组分II、组分III。经冷冻干燥称重得其相对于酶解的蛋白质的得率分别为6.8％、40％、20.3％，其中能够分离出VVYPWTORF活性肽的组分III高于未加入大肠杆菌时的组分III13.5％。
实施例3
ACE抑制肽产率及性状
通过蛋白酶水解结合复合菌酶解的方式，得到ACE抑制肽(VVYPWTORF)的制备新方法，将其产率由原来的0.43％提高到1.5％，产品呈现白色粉末状，无腥味，无苦味，口感较好。
实施例4
复合菌的种类对ACE抑制肽产率的影响试验
本实施例的试验方法及条件参数为E/S为1.5％的胃蛋白酶在pH2.0、37℃酶解牡蛎蛋白24h作为对照；实验组分别在胃蛋白酶水解体系中，加入0.5％不同微生物，其中复合微生物添加比例为1:1。混合均匀后于37±2℃条件下搅拌反应8～10h，之后体系于4±2℃静置8～10h，然后再于37℃搅拌反应6～8h。
表2使用不同复合菌对ACE抑制肽产率的影响
从表2的结果可以看出，通过蛋白酶结合枯草芽孢杆菌和乳酸菌复合酶解的条件下，得到ACE抑制肽(VVYPWTORF)的产率由原来的0.43％提高到1.5％；远远高于其它测试组。
实施例5
酶解方式对ACE抑制肽产率的影响试验
本实施例中，对胃蛋白酶和复合菌共同酶解的方式进行比较：E/S为1.5％的胃蛋白酶中加入0.5％的复合菌剂(枯草芽孢杆菌和乳酸菌,比例为1:1)，酶解程序与结果如表3所示。
表3：不同酶解程序条件下ACE抑制肽的产率
从表3的结果可以看出，37℃连续酶解，水解度略高，尤其是连续37℃酶解24h，水解度最高，为28.6％。但所获得的ACE抑制肽的产率普遍低于分段酶解的结果。从ACE抑制肽产率优化的角度，37℃酶解8h，4℃静置10h，37℃再酶解6h的程序条件是最合适的。