专利名称：一种制备香兰素的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程和化学领域，具体为制备香兰素的方法，特别是以异丁香酚为底物，用血红蛋白制备香兰素的方法。
背景技术：
香兰素是香子兰花荚中的典型香味物质，广泛存在于自然界中，如在香荚兰豆、秘鲁香膏、丁香花蕾油中均有发现。作为一种广谱型高档香料，香兰素广泛应用于食品、香料及医药领域，具有很大的市场发展潜力。目前市场上的香兰素主要有两种来源(1)以愈创木酚和木质素为原料，运用化学法进行合成；( 从植物材料中运用蒸馏、萃取等方法获得天然香兰素。化学合成法得到的香兰素价格便宜，但是随着生活水平的提高和对健康的日益关注，人们对化学合成的香兰素的安全性始终存在怀疑，各国对化学食品添加剂使用的限制规定越来越严格，因此市场上对天然香兰素的需求量呈上升趋势。由于香荚兰等植物来源有限，受产地和自然因素的影响比较大，产量少，培育和处理过程复杂，造成天然香兰素的价格高昂。美国和欧洲的立法机构认为采用生物细胞或其中的组成部分(如生物酶)等生物资源所生产的物质均属于天然产物。为了解决天然香兰素来源有限、价格高昂的问题，近年来人们发展了运用生物技术制备香兰素的方法。生物技术方法可以利用微生物细胞或酶， 通过生物转化或生物合成来制备香兰素。1977年日本学者首次分离得到能够将丁香酚转化为香兰素的微生物菌株，开辟了生物法制备香兰素新途径。目前生物法制备香兰素共有三条路线第一条是以阿魏酸为底物，运用恶臭假单胞菌等微生物直接转化制备香兰素，或者采用两步转化工艺，首先由黑曲霉将阿魏酸转化为香兰酸，再由朱红密孔菌将香兰酸转化为香兰素。这条路线底物转化浓度较高，是有发展潜力的一条路线。但是微生物转化法生产香草醛一般情况下香草醛只是代谢中间产物，会继续降解而不易积累。另外由于阿魏酸的价格较高，利用这种方法生产出来的香兰素价格也相对较高。第二条是以丁香酚或异丁香酚为底物，运用微生物转化制备香兰素的方法，这一路线所需时间长，产量很低，还不具备竞争力。第三条路线是以丁香酚或异丁香酚为底物，直接运用酶催化的方法制备香兰素， 这也是近年来的热点发展方向之一。目前人们已经研究发现香草醇氧化酶、脂肪酶、苯乙烯双氧酶、脂氧合酶能够催化丁香酚或异丁香酚制备香兰素。从研究情况来看，虽然这些酶催化制备香兰素的转化率相对较低，但底物价格低廉，且可以回收再利用，因此有良好的工业应用前景。为进一步拓宽生物催化制备香兰素的方法，有必要对其他生物酶转化丁香酚或异丁香酚生产香兰素的方法进行深入研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种以异丁香酚为底物，利用血红蛋白催化制备香兰素的方法。本发明的目的是这样实现的采用血红蛋白制备香兰素的方法，包括下列步骤取血红蛋白置于PH值为7 10 的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中，加入异丁香酚后，加入过氧化氢，在20 50°C 条件下恒温振荡反应，反应时间3 96小时；磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液浓度为 0. 05 0. 2mol/L ；血红蛋白与异丁香酚、过氧化氢的用量比为Ig 10 500mmol 0 IOmmol ； 优选为 Ig 20 160mmol 0. 1 Immol ；反应体系中血红蛋白浓度为0. 01 50g/L，优选为0. 04 5g/L ；异丁香酚的浓度为1 200mmol/L，优选为10 160mmol/L ；；过氧化氢含量为0 50mmol/L，优选为0. 1 lmmol/L ；振荡反应的速度为50 300转/分，反应时间优选为M 96小时。反应液经乙酸乙酯萃取、蒸干后得到目标产物香兰素。本发明的有益效果和优点在于，采用血红蛋白作为催化剂对异丁香酚进行氧化反应制备出香兰素，香兰素的产率可达45 %，远高于其他生物酶催化制备香兰素的产率。催化剂来源广泛，易于制备，价格低廉。反应步骤简单，反应条件温和，反应所需时间短，催化效果好。并且制备香兰素过程无污染物排放，有利于保护环境，因此具有一定的工业应用开发前景。
具体实施例方式实施例1取0.04g的血红蛋白，悬浮于19.8ml磷酸钠盐缓冲溶液中(0. lmol/L，pH 9.0)，加入1. 22mmol异丁香酚和0. 07mol/L的过氧化氢溶液0. ^il，反应混合物在30°C、160r/min 的恒温摇床上振摇反应，间歇取样用气相色谱(色谱柱为SE-M毛细管气相色谱柱)分析香兰素的含量，反应72小时后，香兰素的分析产率为45%。反应液用乙酸乙酯萃取，得到香兰素。实施例2取0. 03g的血红蛋白，悬浮于18ml Tri s_HCl缓冲溶液中(0. lmol/L, pH 8. 0)， 加入1. 83mmol异丁香酚和0. 07mol/L的过氧化氢溶液^il，反应混合物在30°C、200r/min 的恒温摇床上振摇反应，间歇取样用气相色谱(色谱柱为SE-M毛细管气相色谱柱)分析香兰素的含量，反应72小时后，香兰素的分析产率为34%。反应液用乙酸乙酯萃取，得到香实施例3取0. 02g的血红蛋白，悬浮于20ml Tri s_HCl缓冲溶液中(0. lmol/L, pH 8. 0)， 加入3. 05mmol异丁香酚和0. 07mol/L的过氧化氢溶液0. 02ml，反应混合物在45°C、120r/ min的恒温摇床上振摇反应，间歇取样用气相色谱(色谱柱为SE-M毛细管气相色谱柱)分析香兰素的含量，反应60小时后，香兰素的分析产率为23%。反应液用乙酸乙酯萃取，得到
香兰素。实施例4
取0. 04g的血红蛋白，悬浮于20ml磷酸钠盐缓冲溶液中(0. lmol/L, pH 9. 0)，加入3. 05mmol异丁香酚，反应混合物在30°C、160r/min的恒温摇床上振摇反应，间歇取样用气相色谱(色谱柱为SE-M毛细管气相色谱柱)分析香兰素的含量，反应72小时后，香兰素的分析产率为22%。反应液用乙酸乙酯萃取，得到香兰素。实施例5取0. 03g的血红蛋白，悬浮于20ml磷酸钠盐缓冲溶液中(0. lmol/L, pH 8. 0)，加入1. 22mmol异丁香酚，反应混合物在30°C、160r/min的恒温摇床上振摇反应，间歇取样用气相色谱(色谱柱为SE-M毛细管气相色谱柱)分析香兰素的含量，反应72小时后，香兰素的分析产率为19%。反应液用乙酸乙酯萃取，得到香兰素。以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种制备香兰素的方法，其特征在于，包括以下步骤取血红蛋白和异丁香酚置于PH值为7 10的磷酸盐缓冲溶液或TriS-HCl缓冲溶液中，加入过氧化氢，在20 50°C条件下恒温振荡反应，反应时间3 96小时；血红蛋白与异丁香酚、过氧化氢的用量比为Ig 10 500mmol 0 lOmmol。
2.权利要求1所述制备香兰素的方法，其特征在于，血红蛋白与异丁香酚、过氧化氢的用量比为 Ig 20 160mmol 0. 1 lmmol。
3.权利要求1所述制备香兰素的方法，其特征在于，反应体系中血红蛋白的浓度为 0. 01 50g/L，异丁香酚的浓度为1 200mmol/L，过氧化氢的含量为0 50mmol/L。
4.权利要求1所述制备香兰素的方法，其特征在于，反应体系中血红蛋白的浓度为 0. 04 5g/L，异丁香酚的浓度为10 160mmol/L，过氧化氢的浓度为0. 01 10mmol/L。
5.权利要求1所述制备香兰素的方法，其特征在于，反应体系中血红蛋白的浓度为 0. 04 5g/L，异丁香酚的浓度为10 160mmol/L，过氧化氢的浓度为0. 01 10mmol/L。
6.权利要求1所述制备香兰素的方法，其特征在于，振荡反应的速度为50 300转/分。
7.权利要求1所述制备香兰素的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl 缓冲溶液浓度为0. 05 0. 2mol/L。
8.权利要求1所述制备香兰素的方法，其特征在于，所述反应时间为M 96小时。
全文摘要
本发明公开了一种制备香兰素的方法，是将血红蛋白置于pH值为7～10的磷酸盐缓冲溶液或Tris-HCl缓冲溶液中，加入异丁香酚后，滴加过氧化氢，在20～50℃条件下恒温振荡反应，反应时间3～96小时；血红蛋白与异丁香酚、过氧化氢的用量比为1g∶10～500mmol∶0～10mmol。本方法的香兰素产率可达45％，催化剂来源广泛，易于制备，价格低廉。反应步骤简单，条件温和，时间短，催化效果好；并且无污染物排放，具有一定的工业应用开发前景。
文档编号C07C47/58GK102367222SQ20111036394
公开日2012年3月7日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者徐毅, 白利杰, 陈建波 申请人:上海师范大学