专利名称：精浆果糖酶法定量检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于体外诊断试剂类，具体适用于精浆果糖的定量检测。
背景技术：
在男性不育的临床与理论研究中，精浆果糖作为精囊特异性的分泌指标，一直占有很重要的地位，广泛应用于鉴别单纯性输精管阻塞所致的无精症和输精管、精囊发育不良引起的无精症；另外它也能间接反映雄性激素的分泌水平。
以往国内主要是用间苯二酚法检测精浆果糖，但其方法存在结果准确性不高、样本要去蛋白、温育温度为90℃、需要加入强腐蚀性的浓盐酸等弱点。世界卫生组织(WHO)推荐吲哚法定量检测精浆果糖，但其方法也存在标本要经去蛋白处理、温育温度为50℃，要加入强腐蚀性的浓盐酸、需要在玻璃试管内反应等不足。
发明内容
本发明意在克服现有技术的不足，提供一种操作简单、反应迅速、处理温度低、安全环保的精浆果糖酶法定量检测试剂。
为实现上述目的，本发明提出一种精浆果糖酶法定量检测试剂，包括缓冲液、显色剂、标准品和酶保护液，所述酶保护液为含有果糖脱氢酶的酶保护液，酶保护液中果糖脱氢酶的含量优选3000～8000U/L。
所述含有果糖脱氢酶的酶保护液为冻干粉，还包括冻干粉溶解液，冻干粉溶解液是酶保护液。
所述缓冲液为含防腐剂的柠檬酸缓冲液。
所述显色剂为含有碘唑四氮蓝(4-Fluoro-3-nitrobenzotrifluoride简称NBT)或碘硝基四氮唑紫(p-Iodonitrotetrazolium violet简称INT)、酚嗪二甲酯硫酸盐(4-Amidinophenylmethanesulfonyl fluoride hydrochloride，简称PMS)的去离子水溶液。
包括终止液，用于终止酶促反应。
所述终止液为含有稀酸的溶液。
由于上述技术方案，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于样本无需进行去蛋白处理，操作更简单，检测更方便，更适于临床应用；采用果糖脱氢酶，加快反应速度，整个反应过程只需40分钟；采用稀酸作为终止液，较强腐蚀性的浓盐酸更安全、环保；温育温度为37℃，比间苯二酚法和吲哚法中的温育温度都低，在操作中更安全；将酶保护液冻干，并在缓冲液中采用了防腐剂，使得试剂更稳定，贮存期可达一年。
具体实施例方式
下面通过具体的实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例，一种精浆果糖酶法定量检测试剂，包括缓冲液、显色剂、酶保护液冻干粉、果糖标准液(8mM)、酶保护液冻干粉溶解液和终止剂。其中1000ml缓冲液含有叠氮钠(NaN3)0.15g、柠檬酸9.5g；每100ml酶保护液冻干粉中含有果糖脱氢酶450U；酶保护液冻干粉溶解液是酶保护液；显色剂是含有NBT和PMS的去离子水溶液，每100ml显色剂中含有NBT 0.03克、PMS0.45克；终止剂是含有浓硫酸的去离子水溶液，每1000ml终止剂中含有浓硫酸27.5毫升。
上述精浆果糖酶法定量检测试剂中的各成分采用如下工艺方法制得A、缓冲液的制作工艺方法1)用分析天平称取柠檬酸9.5g，NaN30.15g，加去离子水至950ml搅拌溶解。
2)调节pH(以1mol/l氢氧化钠)至4.7～4.9。
3)用去离子水定容至1000ml，过滤后4℃保存；B、酶保护液冻干粉的制作工艺方法4)取果糖脱氢酶450U，加入少量进口酶保护液振荡溶解后，用酶保护液定容至100毫升。
5)分装后冻干，4℃保存；C、冻干粉溶解液的制作工艺方法6)进口酶保护液，4℃保存；D、显色剂的制作工艺方法7)用分析天平准确称量NBT 0.03克，置于烧杯内加去离子水90毫升。
8)再加入PMS0.45克，待完全溶解后以去离子水定容至总体积100ml；E、果糖标准液贮存液(8mM)的制作工艺方法9)用分析天平准确称取果糖0.7206g，NaN30.25g，加灭菌去离子水定容至500ml。
10)滤过除菌，4℃保存；F、终止剂的制作工艺方法11)准确量取浓硫酸27.5毫升，置于烧杯内，沿烧杯壁缓缓加入900毫升去离子水内，边加边搅拌。
12)待溶液恢复至室温后移入1000毫升装容量瓶内，用去离子水定容至1000毫升。4℃保存。
上述实施例中，缓冲液是NaN3含量为0.01～0.1％的柠檬酸缓冲液，NaN3在缓冲液中起防腐剂的作用；酶保护液冻干粉是果糖脱氢酶含量为3000～8000U/L的酶保护液冻干粉，一般而言，精浆果糖酶法定量检测试剂的酶保护液中，果糖脱氢酶含量的下限为3000U/L，为控制成本，果糖脱氢酶的含量的上限为8000U/L，在3000～8000U/L的范围内，果糖脱氢酶的含量越高，催化反应到终点的速度越快；酶保护液冻干粉溶解液是酶保护液；显色剂是NBT含量为0.01～0.1％、PMS含量为0.2～0.8％的去离子水溶液，显色剂中NBT的含量0.01～0.1％和PMS的含量0.2～0.8％是与足量的果糖脱氢酶催化精浆果糖脱氢后的氢原子反应的有效量，NBT还可以用INT或其他常用的显色剂替换，PMS还可以用其他的常用显色剂替换；终止剂是浓硫酸含量为2～4％的去离子水溶液，终止剂只要是稀酸溶液就行了，其中浓硫酸还可以用其他的酸来替换。
试验例，用精浆果糖酶法定量检测试剂检测精浆果糖含量，具体步骤为一、试剂准备1、每瓶酶保护液冻干粉加0.6ml酶保护液冻干粉溶解液溶解，室温溶解30min，待用。
2、配制工作液，方法是缓冲液9份，加显色剂1份，充分混匀，待用。
二、样本准备新鲜精液液化后，迅速取部分精液2000g离心10分钟；取精浆用蒸馏水1∶4稀释。
三、标准曲线制备将8mmol/L果糖标准液向下对倍稀释为4、2和1mmol/L三个浓度，用蒸馏水作为零标准浓度，即标准管S1～S5中果糖浓度分别为0、1、2、4、8mmol/L。
四、检测步骤
1、取微孔板条若干，各检测孔在微孔板上的位置排列方式如表一 表一微孔板上各检测孔的排列表一中，S代表标准孔，SB代表标准空白孔，R代表标本测定孔，RB代表标本对照孔。
2、在微孔中完成下列操作标准管(0，1，2，4，8mM) 标准空白管测定管标本对照管(S1～S5) (SB) (R) (RB)稀释标本(ul) ---- ---- 1010标准液(ul) 10---- ---- ----酶保护液(ul) 15---- 15----工作液(ul) 200 200 200 200振荡混匀，封片，37℃避光准确反应40min去掉封板膜，每孔加终止液50ul，振荡混匀。上酶标仪490nm比色各管吸光度(OD)OD1OD2OD3OD4五、比色与计算因为标本的吸光度(OD)与标本的浓度的比值等于标准液的OD值与标准液的浓度的比值，即
同时已经用蒸馏水将精浆标本稀释了4倍，因此在计算标本浓度时也相应地将标准品的浓度乘以4。
综上所述，计算精浆中果糖含量(C标本)的公式如下 其中，ΔOD标本＝OD3-OD4，ΔOD标准＝OD1-OD2标准实际浓度(mmol/L)输入酶标仪的应用浓度(mmol/L)0 01 42 84 168 32以Bio-Tek ELx800酶标仪为例，程序设置主要参数如下MAPPING DIRECTIONDOWN；BLANK MAPP-DOWN；ENTER NUMBER OF STANDARDS05ENTER NUMBER OF STANDARD REPLICATES01CONCN.OF STD10CONCN.OF STD24CONCN.OF STD38CONCN.OF STD416CONCN.OF STD532按“平滑曲线(QUAD)”方式拟合标准曲线酶标仪打印输出结果，即为检测标本真实浓度(mmol/L)。
六、结果报告果糖最终检测结果以“μmol/一次射精”方式报告。
一次射精精浆果糖量(μmol)＝精浆果糖浓度(mmol/L)×一次射精的精液总体积(ml)七、正常参考值一次射精的精浆果糖含量≥13μmol。其中13μmol是根据WHO推荐的参考值。
八、临床适用性1、可判断精囊分泌功能；2、结合精浆中性α-葡糖苷酶的检测，可判断梗阻性无精症的梗阻部位。
权利要求
1.一种精浆果糖酶法定量检测试剂，包括缓冲液、显色剂、酶保护液和标准品，其特征是所述酶保护液是含有果糖脱氢酶的酶保护液。
2.如权利要求1所述的精浆果糖酶法定量检测试剂，其特征在于所述酶保护液中果糖脱氢酶的含量为3000～8000U/L。
3.如权利要求1或2所述的精浆果糖酶法定量检测试剂，其特征在于所述含有果糖脱氢酶的酶保护液为冻干粉，还包括冻干粉溶解液，所述冻干粉溶解液是不含果糖脱氢酶的酶保护液。
4.如权利要求3所述的精浆果糖酶法定量检测试剂，其特征在于所述缓冲液为含防腐剂的柠檬酸缓冲液。
5.如权利要求1或2所述的精浆果糖酶法定量检测试剂，其特征在于所述显色剂为含有碘唑四氮蓝或碘硝基四氮唑紫、酚嗪二甲酯硫酸盐的去离子水溶液。
6.如权利要求5所述的精浆果糖酶法定量检测试剂，其特征在于所述显色剂中碘唑四氮蓝或碘硝基四氮唑紫的含量为0.01～0.1％、酚嗪二甲酯硫酸盐的含量为0.2～0.8％。
7.如权利要求3所述的精浆果糖酶法定量检测试剂，其特征在于所述显色剂为碘唑四氮蓝或碘硝基四氮唑紫的含量为0.01～0.1％、酚嗪二甲酯硫酸盐的含量为0.2～0.8％的去离子水溶液。
8.如权利要求1或2所述的精浆果糖酶法定量检测试剂，其特征在于还包括终止液，用于终止酶促反应。
9.如权利要求8所述的精浆果糖酶法定量检测试剂，其特征在于所述终止液为含有稀酸的溶液。
10.如权利要求3所述的精浆果糖酶法定量检测试剂，其特征在于还包括终止液，所述终止液为含有稀酸的溶液。
全文摘要
本发明公开一种精浆果糖酶法定量检测试剂，包括缓冲液、显色剂、标准品和酶保护液，所述酶保护液为含有果糖脱氢酶的酶保护液。所述酶保护液为冻干粉，还包括冻干粉溶解液，用于溶解酶保护液冻干粉。所述缓冲液为含防腐剂的柠檬酸缓冲液。还包括终止液，用于终止显色反应。所述终止液为含有稀酸的溶液。采用本发明，样本无需进行去蛋白处理，操作更简单，反应速度快，整个反应过程只需40分钟，试剂稳定，2～8℃保存贮存期可达一年。
文档编号C12Q1/54GK1595153SQ20041004024
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月14日 优先权日2004年7月14日
发明者傅剑华, 刘瑜, 胡家纯, 何林, 何小红 申请人:深圳华康生物医学工程有限公司