一种用于检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段检测微生物耐药基因的方法，具体为一种用于检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的分子标记及其应用。
背景技术：
：1922年，细菌学家从鼻涕培养物中发现了一种“溶菌酶”，这便是青霉素的原型。1927年，弗莱明正式发表文章声明青霉素的发现。但直到1939年澳大利亚人费罗里和德国人钱恩，才发明了青霉素的提纯技术，两年之后青霉素开始正式应用于临床。从此，细菌性疾病的治疗进入了一个新的时代。在之后的数十年里，抗菌药物家族不断壮大，新型抗菌药物不断被用于感染性疾病的治疗，为无数与疾病斗争的人们带来了福音。但随着抗菌药物的广泛使用，细菌耐药性问题越来越严重，细菌耐药突变菌株的出现再一次让感染性疾病的治疗成为世界难题。有研究表明，人类“超级细菌”——抗甲氧西林金黄色牛源大肠杆菌，其中部分变异菌株是来自于猪的一种新型细菌。全球因各类传染病平均每年死亡1700多万人，其中耐药菌株的广泛传播和多重耐药菌株的出现为其主要原因之一。据报道，1972年墨西哥有1万余人感染耐氯霉素伤寒杆菌，导致一千多人治疗无效死亡；1992年美国有1.3万余人死于耐药突变菌的感染。大肠杆菌是人和动物肠道中最主要的一种共生菌，亦是危害人类及动物健康的重要致病菌，其某些血清型具有强致病性，可引起人类和多种动物发生腹泻，甚至死亡。由于大肠杆菌并多并发或继发于其他病毒或细菌性疾病，所以在畜禽养殖中抗菌药物常常作为饲料添加剂使用，往往会给畜牧业造成严重的经济损失。技术实现要素：本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种检测喹诺酮类药物对大肠杆菌突变选择窗的影响，探明牛源大肠杆菌的耐药现状及流行的耐药基因类型的方法，本发明提供了一种用于检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的分子标记及其应用。技术方案：一种用于检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。优选的，所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。表1分子标记序列名称序列(5’-3’)seqidno.p1-fnh2-t(10)gcaaaccggactacgtcacc1p1-rtcaatcctcttcggagttccc2p2-fnh2-t(10)acgtctatgccaaccgtcctg3p2-rgcagtgccaccgccaatgtcc4p3-fnh2-t(10)tgtaacacgcaagcacgatg5p3-raaccttctccgccccgagt6所述分子标记在制备检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因试剂盒中的应用。优选的，所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。优选的，所述试剂盒检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的牛源大肠杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10～60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～400倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释20～100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。优选的，所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。优选的，所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。优选的，所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。优选的，所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。有益效果：(1)本发明所述分子标记在细菌感染治疗过程中可以实时检测耐药突变菌株的产生，能够对抗菌药物的抗菌效力及其防耐药突变能力进行评价；(2)本发明所述分子标记具有特异性高、灵敏度强、稳定性好的优点。附图说明图1是实施例1～3检测结果图；其中，m为分子量为1000bp的maker；1为实施例1pcr产物电泳结果；2为实施例2pcr产物电泳结果；3为实施例3pcr产物电泳结果。具体实施方式实施例1一种用于检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的牛源大肠杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入10μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释100倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例2一种用于检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的牛源大肠杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入30μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释400倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释20倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。实施例3一种用于检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的分子标记，所述分子标记及其序列为：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。所述分子标记p1、p2和p3的上游引物5’端进行氨基化修饰并附加10个碱基t。所述分子标记在制备检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因试剂盒中的应用。所述试剂盒的组分包括：分子标记、dntp、lataq、pcr反应缓冲液、mgcl2、双蒸水。所述试剂盒检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的步骤包括：(1)取样：选取纯化后的牛源大肠杆菌，划线接种培养基，形成单个菌落，向无菌ep管中加入60μl60％的甘油，用接种针挑取单菌落于甘油中洗涤数次，-20℃保存；(2)以步骤(1)收集的菌体作为pcr模板，以p1为特异性引物，进行第一轮pcr扩增；(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释200倍后作为第二轮pcr的模板，以p2作为特异性引物，进行第二轮pcr扩增；(4)取第二轮pcr扩增的产物，稀释50倍后作为第三轮pcr的模板，以p3作为特异性引物，进行第三轮pcr扩增；(5)收集第三轮pcr扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。所述pcr扩增的体系为25μl：模板2μl、pcr反应缓冲液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子标记1μl、双蒸水15.5μl。所述第一轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。所述第二轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35个循环；72℃，5min。所述第三轮pcr扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35个循环；72℃，4min。sequencelisting<110>苏州乔纳森新材料科技有限公司<120>一种用于检测牛源大肠杆菌喹诺酮耐药基因的分子标记及其应用<130><160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gcaaaccggactacgtcacc20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2tcaatcctcttcggagttccc21<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3acgtctatgccaaccgtcctg21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4gcagtgccaccgccaatgtcc21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5tgtaacacgcaagcacgatg20<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6aaccttctccgccccgagt19当前第1页12