大豆延伸因子家族在抗大豆花叶病毒中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于大豆基因工程领域，设及大豆延伸因子家族在抗大豆花叶病毒中的应 用。
【背景技术】
[0002] 大豆花叶病毒（SoybeanMosaicVirus,SMV)是对大豆生产影响最大的病毒之一， 全球范围内的大豆产区受SMV不同程度的影响，病害发生时影响大豆产量和巧粒外观。SMV 是单链正义的RNA，含一个开放阅读框，转录产生一条多肤，经自身蛋白切割成11个成熟的 蛋白。其中至少鉴定了 3个蛋白对SMV的毒性和寄主侵染范围有重要影响，P3是其中的一 个。
[0003] 大豆基因组虽然早在2010年完成测序，但是其中各个基因的功能却并没有公开。 如果能从中找出与大豆花叶病毒抗性相关的基因，并对其抗感病机制进行探讨，将有助于 通过基因工程的手段构建抗大豆花叶病毒的转基因植株。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供大豆延伸因子家族在抗大豆花叶 病毒中的应用。
[0005] 本发明的目的可通过W下技术方案实现：
[0006] 大豆延伸因子GmEFla在通过内质网应激调控大豆抗大豆花叶病毒中的应用，其 中所述的大豆延伸因子GmEFla基因序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 所述的应用优选沉默大豆延伸因子GmEFla能够提高宿主对大豆抗大豆花叶病毒 的抗病性。
[0008] 沉默大豆延伸因子GmEFla基因的载体在提高植株大豆花叶病毒抗病性中的应 用。
[0009] 其中，所述的沉默大豆延伸因子GmEFla基因的载体为转入宿主植株能够引起宿 主植株中GmEFla基因沉默的载体。
[0010] 所述的沉默大豆延伸因子GmEFla基因的载体优选将GmEFla基因的一部分片段插 入BPMV-RNA2载体所得；进一步优选将SEQIDNO. 3所示的GmEFla基因的ISObp片段插入 BPMV-RNA2载体所得。
[0011] 大豆延伸因子GmEF化在通过内质网应激调控大豆抗大豆花叶病毒中的应用，其 中所述的大豆延伸因子GmEF化基因序列如SEQIDNO. 2所示。
[0012] 所述的应用优选沉默所述的大豆延伸因子GmEF化能够提高宿主对大豆抗大豆花 叶病毒的抗病性。
[0013] 沉默大豆延伸因子GmEF化基因的载体在提高植株大豆花叶病毒抗病性中的应 用。
[0014] 所述的沉默大豆延伸因子GmEF化基因的载体为转入宿主植株能够引起宿主植株 中Gn￡F化基因沉默的载体。
[0015] 所述的沉默大豆延伸因子Gn^F化基因的载体优选将Gn^Ub基因的一部分片段插 入BPMV-RNA2载体所得；进一步优选将SEQIDNO. 4所示的Gm邸化基因的222bp片段插入 BPMV-RNA2载体所得。
[0016] 有益效果：
[0017] 本发明构建了一套基于泛素裂解的酵母双杂交文库，用P3做诱巧对文库进行筛 选，得到的寄主互作因子进行与病原物抗性的相关功能分析。我们用基于菜豆芙斑驳病毒 度ean化dMottleVirus,BPMV)为载体的病毒诱导的基因沉默系统，对与P3互作的寄主 因子进行沉默，获得的沉默材料分别在抗感不同大豆品种接种不同的SMV株系，并检验对 马铃馨Y病毒属其它病毒及细菌等不同病原物的抗性反应。在SMV的感病品种中沉默延伸 因子家族GmEFla基因和GmEF化基因，结果显示沉默植株比对照抗病。
[001引SMV复制发生在内质网上，需要GmEFla和GmEF化的参与，SMV的聚集引起内质网 应激反应，沉默GmEFla和GmEF化会降低内质网应激反应，植株表现更抗病。
[0019] 可见沉默延伸因子家族GmEFla基因和GmEF化基因可用于构建抗SMV病毒的转基 因植株。且由于运两个基因都源于大豆，因此，对转基因大豆的安全性有进一步提高。
【附图说明】
[0020] 图1文库质量鉴定
[0021] 图2 18个重要蛋白分别于P3共转化验证
[0022] 图3BiFc验证S个株系的P3与GmEFla互作
[0023] 图4免疫共沉淀验证SCl5-P3和GmEFla互作
[0024] 图5GmEFla,GmEF化和P3的亚细胞定位
[00巧]图6在SD/-His/-Leu上筛选GmEFla和P3的核定位信号
[0026] 图7亚细胞共定位表达GmEFla-CFP和P3-YFP，W及GmEF化-CFP和P3-YFP
[0027] 图8GmEFla的不同拷贝基因沉默效率
[002引 图9GmEF化的不同拷贝基因沉默效率
[0029] 图10SHEFla与SiWF化对SMV的症状表现
[0030] 图11Westernblot检测Essex背景下接种叶和系统叶SMV-CP含量
[0031] 图12Westernblot检测Rsvl背景下接种叶和系统叶SMV-CP含量
[0032] 图13ELISA检测Essex和Rsvl背景下接种叶和系统叶SMV粒子含量
[0033] 图14Western检测Essex背景下接种叶和系统叶BYMV-CP含量
[0034] 图15接种SMV-G7后细胞坏死基因的表达
[003引 图16邸膜蛋白和SMV的分离
[0036] 图17SMV侵染后URP相关基因表达
[0037] 图18TM和DTT诱导大豆内质网应激反应后的SMV表达水平
[003引 图19TM和DTT诱导大豆内质网应激反应后的BYMV表达水平
[0039] 图20突变体转录水平检测
[0040] 图21突变体接种TCV后的病毒含量
[0041] 图22突变体接种CMV后的病毒含量
[0042] 图23内质网应激诱导后拟南芥TCV的表达量
[0043] 图24内质网应激诱导后拟南芥CMV的表达量
【具体实施方式】
[0044] 实施例1酵母双杂交文库的构建及与P3互作的寄主因子的筛选
[0045]W南农1138-2接种SMV强毒株系SC15后的RNA为材料，构建了WpPR3为终端载 体的S框型酵母双杂交cDNA文库。用文库鉴定引物上游引物：5'GTCGAAAATTCAAGACAAGG3' 和下游引物：5'AAGCGTGACATAACTAATTAC3'，对文库质量进行鉴定菌落PCR，程序如下：
[0046] IOxburibr 5u! ClNTP(IOmM) 4u! Taq 酶（5U/|il) 0.5 Mg訂（25mM) 4'ul 上游引物 1山 下游引物 Ilil done 2}.ii dclH.O 50 |,i)
[0047]I%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对酵母双杂交文库质量鉴定发现（图I)，文库 库容量为0. 68XIO7;随机挑取的32个克隆，PCR显示文库的插入片段在SOObp到4. 5化之 间，文库重组率高达94%。库容和插入片段结果显示文库质量较高，适合用于酵母双杂交文 库的筛选。
[0048]SC15-P3蛋白为诱巧对CDNA文库进行筛选，随机挑选120个阳性克隆，对运120个 克隆进行测序，BLAST序列比对发现与之对应的蛋白功能可分为：延伸因子1A、防卫素、叶 绿体光系统II蛋白、DNA结合、信号转导、膜相关蛋白、转录因子、未知蛋白9类。
[0049] 选取重要的18个蛋白（基因）进行与P3 -对一互作验证，根据Gateway原理，通 过BP反应和LR反应把互作子序列重组到酵母双杂交捕获载体PPR3-N-R1R2上。将获得的 互作子酵母载体，热激转化到含地T3-P3的酵母感受态中，转化如下：
[0050] 制备运载DNA:取娃鱼精20y1于沸水中煮5min后，瞬时离心冰水混合物中静置 5min，重复操作一次；
[0051] 配置PEG和TE\LiAc混合液：
[0052]PEG:800"，TE: 100"，LiAc: 100 ";
[0053] 按照W下比例配置反应液：
[0054] Plasmid 3財 CarrierDNA 5ul pBT3-P3Ycaslcell 50yii PEG和TEVLiAc混合液 熟0知
[0055] 30°C水平放置30min，每隔IOmin混匀一次；
[005引加入20y1DMS0,上下颠倒混匀；
[0057] 42°C热激15min，每隔5min拿出混匀；
[0058] 高速离屯、，去上清，加入Iml YPDA悬浮菌体；
[0059]30°C，200巧m解育 1.化；
[0060] 离屯、去上清，加入0. 9%化Cl,混匀涂布四缺培养基SD/-Leu/-T巧/His/-Ade平 板，30°C倒置培养3-4天检测平板生长状况。
[0061] 挑取生长正常的菌落，在二缺培养基SD/-Leu/-T巧中摇菌，到OD为0. 6,离屯、去上 清，分别用0. 9 %化Cl重悬，取5y1滴到含X-a-Gal的SD/-Leu/-T巧/His/-Ade四缺培 养板上。3(TC倒置培养3-4天检测平板生长状况，图2显示在酵母中均与P3存在较强的互 作。
[006引PCR扩增克隆得到GmEFla的全长，扩增所用上游引物：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAA MGCAGGCTTCATGGGTAAGGAAAAGGTTCACAT-3'（SEQIDNO. 5)，下游引物：5Lggggaccactttgta CAAGAAAGCTGGGTCCTTCTTCTTCTGGGCAGCCTTGGT-3'（SEQIDNO. 6)。酵母内验证均与SC15-P3 存在较强的互作关系。双分子巧光互补度iFc)验证互作关系的存在，分别把目的基因导入 BiFc载体，转化至根癌农杆菌LBA4404,并于含有50mg/ml壮观霉素和50mg/ml链霉素的 LB液体培养基中，28°C，220巧m振荡培养，至对数生长期（ODe。。= 0. 6左右），3000巧m离屯、 lOmin，除去上清收集菌体。采用注射培养液重悬菌体，其中包含终浓度为lOmmol/LMgClz、 lOOmmol/LMES(抑=5. 6)、100ymol/L乙酷下香酬，调整菌液浓度，使其ODe。。约为I. 0左 右，室溫放置化。等量混合菌体悬浮液，选取烟草幼苗充分展开的中上部叶片，用Iml无针 头注射器在叶片背部平坦处，一只手指托住叶面，一手用无针头的注射器将菌体悬浮液从 叶片背面慢慢注入叶片组织空隙。将植物表达载体转化至烟草叶片细胞后，在25°C下培养 2天，使融合P3-MYC在烟草叶片细胞中充分表达。用干净的手术刀剪取注射后的叶片组织， 叶片背部朝上放置在载玻片上，滴加无菌(1地20覆盖，加盖盖玻片，用綴子轻轻敲压排出气 泡。制备好的玻片放于激光共聚焦显微镜下，选取YFP的激发波长488nm，调节焦距至图像 清晰，观察并拍摄照片，记录巧光出现的位置。双分子巧光互补发现（图3)，SC15-P3在细 胞质和细胞核内存在相互作用。同时BiFc显示GmEFla与美国株系G5和G7的P3在细胞质 和细胞核均存在相互作用。尽管研究显示potyvirus属中P3是变异最大的蛋白之一，G5、 G7和SC15 =个株系的P3之间存在与GmEFla互作的保守结构。
[0063] 通过LR反应，将GmEFla重组到含有FLAG标签的植物表达载体pGWBll中，把 SC15-P3重组到含MYC标签的植物表达载体PGWB20中，热激转化农杆菌LBA4404。瞬时表 达单独GmEFla-FLAG、和SC15-P3-MYC，W及GmEFla-FLAG和SC15-P3-MYC的混合物于野生 型本氏烟。具体方法参照同上。
[0064] 2天后采集注射过菌液的烟草叶化用GT肥缓冲液提取总蛋白，取部分总蛋白