一种柳枝稷遗传转化的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物生物工程技术领域，具体地设及一种植物遗传转化的方法，特别 是设及一种柳枝稷遗传转化的方法。
【背景技术】
[0002] 纤维生物质资源是地球上最丰富的原料，但由于一些关键技术的缺乏，当前能够 用作能源生产的纤维生物质资源不到1 %。基因工程育种能够快速克服物种间的基因壁垒， 从而在短时间内培育出高产抗逆且可高效转化的新型能源草资源。因此采用基因工程的策 略，挖掘和鉴定能够决定能源草生物量、品质和抗逆性的关键基因资源，并获得相应的遗传 改良植物，有助于解决纤维生物质开发与利用过程中存在的资源不稳和品质不佳的瓶颈问 题。
[0003] 柳枝稷Ki巧?別歴L)是C4多年生（10-12年）高大草本植物，主要用作 牧草和能源草，是重要的纤维生物质资源。随着高通量测序技术的发展，柳枝稷的全基因组 已经完成测序。然而面对海量的序列信息，如何通过高通量的遗传转化体系筛选获得具有 潜在应用价值的基因资源，仍然是当前所面临的一个巨大挑战，因此柳枝稷的遗传改良研 究受到了世界各国科研工作者的广泛关注。像大多数单子植物一样，柳枝稷难于通过农杆 菌介导的方法进行遗传转化。目前报道的大部分柳枝稷遗传转化体系的效率低于10%。另 夕F，先前报道的转基因柳枝稷植物大部分使用潮霉素筛选获得，少数通过双丙氨麟筛选产 生，但使用卡那霉素进行筛选的柳枝稷遗传转化体系尚未建立。
[0004] 像大多数转基因植物商业化生产一样，优良转基因柳枝稷植株的获得需要从成千 上万棵独立的转基因植物群体中进行千里挑一或万里挑一的筛选工作。因此建立高效且低 成本的柳枝稷遗传转体系是转基因能源植物的商业化研发的首要目标和核屯、内容，也是柳 枝稷重要农艺性状遗传改良和分子设计的基础。卡那霉素价格低廉，市售价格在2-3元/g, 而潮霉素和双丙氨麟的平均市售价格分别为1500元/g和18000元/g,因此如果能够建立 禾本科牧草和能源草的卡那霉素抗性筛选体系，将会极大降低柳枝稷转基因植物生产的成 本，具有巨大的商业化应用潜力和广阔的市场前景。而该体系的建立有助于加速专用纤维 生物质资源新品种的定向培育，为纤维生物质液体燃料生产提供充足稳定且可高效转化的 优质低成本生产原料。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供提供一种柳枝稷高效低成本的遗传转化体系，用于禾本科牧 草和能源植物重要经济性状的遗传改良和分子设计。
[0006] 本发明是通过如下技术方案来实现的： 一种柳枝稷遗传转化的方法，它的内容包括： 使用含有双元载体的农杆菌侵染柳枝稷typeII型高质量胚性愈伤组织，并通过卡那 霉素抗性筛选体系获得阳性转基因柳枝稷植株。
[0007] 进一步，所述的柳枝稷type II型高质量胚性愈伤组织诱导自柳枝稷成熟的种子， 该愈伤组织的外部特征为淡黄色、结构疏松且具有溫润的光泽，其建立的方法包括：柳枝稷 成熟种子的消毒，愈伤组织的诱导、type II型高质量胚性愈伤组织的获得和扩繁。
[000引在上述技术方案的基础上，所述的农杆菌菌株为公倒W頌^齡ZA
[0009] 进一步，所述的用于柳枝稷遗传转化的双元载体含有卡那霉素抗性基因（^^ //)，除了含有上述筛选标记基因外，适合本发明使用的质粒还含有一个或一个W上的不同 目的基因。
[0010] 本发明可用于在植物中过表达或RNAi抑制任何基因。目的基因可W是逆境抗性 基因、耐除草剂基因、细胞壁调控基因和生物量大小决定基因等。
[0011] 本发明中所述的柳枝稷的生态型为低地型和高地型。
[0012] 本发明中所述的抗性筛选试剂为卡那霉素。
[0013] 一种柳枝稷遗传转化的方法，它具体包括柳枝稷成熟种子的消毒，type II型高质 量胚性愈伤组织的诱导和扩繁、卡那霉素筛选获得农杆菌侵染后的抗性愈伤W及抗性愈伤 再生和生根并最终获得阳性转基因柳枝稷植株步骤。
[0014] 所述的柳枝稷成熟种子消毒，将柳枝稷的成熟种子用3% (W/V)次氯酸巧消毒2小 时后，使用无菌蒸馈水清洗3次(每次5分钟)，然后置于4°C冰箱过夜，次日继续使用5%(W/ V)次氯酸巧消毒1. 5小时，然后使用无菌蒸馈水清洗3次(每次5分钟）。
[0015] 所述的type II型高质量胚性愈伤组织的获得，把消毒清洗后的柳枝稷成熟种子 接种于愈伤组织诱导培养基（MSD5)上，培养箱溫度25 ± 2 °C，暗培养6-7周，获得愈伤组织。 把所获得的愈伤组织采用目视法进行筛选，选择其中淡黄色、结构疏松且具有溫润的光泽 的胚性愈伤组织即为type II型高质量胚性愈伤组织，将获得的type II胚性愈伤组织进 行继代扩繁，培养箱溫度25 ± 2 °C，暗培养，每3-4周继代一次。
[0016] 所述的愈伤组织的农杆菌侵染，把所述的扩繁的typeII型高质量胚性愈伤组织 分成小块，然后置于=通干燥皿中抽真空，使用含有携带卡那霉素抗性基因（畔^ //)的双 元载体的农杆菌菌液对所述的柳枝稷typeII型高质量胚性愈伤组织进行共解育，然后去 除残留的农杆菌菌液，25±2°C，黑暗中共培养3天，将共培养后的愈伤组织转接于抗性愈 伤组织筛选培养基MSD3K进行筛选，培养箱溫度25 ± 2°C，暗培养，每3个周转接一次，直到 抗性愈伤组织长出，将获得的抗性愈伤组织转接到抗性愈伤组织筛选培养基MSK2K上，组 培室溫度25 +2°C，光照时间每天1化光/化暗，每4个周转接一次，直到抗性芽长出；获得 的抗性再生芽转接至生根培养基MSR上，组培室溫度25±2°C，光照时间每天1化光/化暗； 获得的再生苗按照常规方法移栽到±中，2周后再生苗成活。
[0017] 进一步，所述的抗性愈伤组织筛选培养基MS3DK(pH=5. 8)为MS基本培养基添加 30g/L薦糖、3mg/L2, 4-D、150mg/L卡那霉素、400mg/L头抱塞朽钢和7. 5g/L琼脂，高压灭菌 15min。
[0018] 进一步，所述的抗性芽再生培养基MSK2K(pH=5.8)为MS基本培养基添加30g/L薦 糖、2mg/L激动素、50mg/L卡那霉素、400mg/L头抱塞朽钢和7.5g/L琼脂，高压灭菌15min。
[0019] 进一步，所述的抗性芽生根培养基MSR(pH=5. 8)为1/2MS基本培养基添加15g/L 薦糖、400mg/L头抱塞朽钢和7. 5g/L琼脂，高压灭菌15min。
[0020]本发明中所述的农杆菌侵染率愈伤系的平均遗传转化效率为60%，从农杆菌侵染 柳枝稷愈伤组织到转基因植物溫室移栽的周期为4-5个月，每人每年能够转化至少100个 基因，产生大于2000棵独立的阳性转基因植株。
[0021] 本发明中的基因克隆、载体构建和农杆菌侵染均可使用标准方法实现。
[0022] 本发明的核屯、特点在于柳枝稷遗传转化体系兼具高效和低成本两大优势，且首次 在柳枝稷中成功建立卡那霉素抗性筛选体系，从而确保获得足够数量的阳性转基因植物用 于牧草和能源草的商业化生产。
[0023] 本发明与现有技术相比的有益效果： 1)转化效率高：本发明产生阳性转基因柳枝稷植物的遗传转化效率高达60%，从愈伤 组织的农杆菌侵染到转基因植物溫室移栽仅需要4-5个月，从而能够实现每人每年转化至 少100个基因载体，产生大于2000棵独立的阳性转基因植株的工作效率。
[0024] 2)成本低廉：植物抗性筛选剂是决定转基因植物生产成本的一个重要因素，本发 明的方法首次使用价格低廉的卡那霉素作为转基因柳枝稷植物的抗性筛选试剂，是当前柳 枝稷遗传转化中普遍使用的潮霉素和双丙氨麟使用成本的1/100,从而极大降低了转基因 植物商业化生产的成本。
[00巧]3)限制性小：本发明中高质量胚性愈伤组织诱导于植物成熟种子，其来源丰富，能 够提供足够数量的typeII型高质量胚性愈伤组织，且获得的高质量胚性愈伤组织可通过 继代扩繁持续保存，不受植物发育时期的限制，能够保证用于遗传转化的外植体材料的持 续充足供应。
[0026] 表1巧啦稷遗传转化中不同植物抗性筛选剂的使用成本比较
【附图说明】
[0027] 图1 :实施例1中柳枝稷成熟种子诱导的typeII型高质量胚性愈伤组织。
[0028] 图2 :实施例2中农杆菌介导的柳枝稷遗传转化流程。A.实施例2中用于柳枝稷 遗传转化的双元载体T-DNA简图。pMDC100双元载体含有卡那霉素抗性基因（Wt//)，可 用于柳枝稷遗传转化体系的建立；B.农杆菌侵染后的愈伤组织共培养；C.卡那霉素筛选的 抗性愈伤组织；D.卡那霉素筛选的抗性芽化生根的抗性芽(抗性苗）；F.溫室生长的转基 因柳枝稷植物。
[002引图3 :实施例3中转基因柳枝稷植物的PCR鉴定。M:DNAMarker; 1-13 :转化的柳 枝稷植株；Ck- :PCR系统的阴性对照(无DNA模板);WT:未转基因的野生型柳枝稷植物；CK+ : pMDClOO双元载体质粒。
[0030]
【具体实施方式】： 下面W低地型柳枝稷遗传转化体系的建立为实施例对本发明的原理和特征进行描述， 所举实例只用于解释本发明，并非用于限定发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂、 双元载体和农杆菌等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购到，所述的MS基本培养 基购自PhytoTechnologyL油oratories(货号：M519)。
[0031] 实施例1:柳枝稷typeII型高质量胚性愈伤组织的获得和扩繁，其包括W下步 骤： 1)将柳枝稷的成熟种子用3% (W/V)次氯酸巧消毒2小时后，使用无菌蒸馈水清洗3次 (每次5分钟)，然后置于4°C冰箱过夜，次日继续使用5% (W/V)次氯酸巧消毒1. 5小时，然 后使用无菌蒸馈水清洗3次(每次5分钟)，接种于愈伤组织诱导培养基（MSD5)上，并对每 一颗种子进行编号，培养箱溫度25 ± 2 °C，暗培养6-7周，获得愈伤组织。
[0032] 2)将步骤（1)所获得的愈伤组织采用目视法挑选其中淡黄色、结构疏松且具有溫 润的光泽的typeII型高质量胚性愈伤组织（图1)，接种于MSD5培养基上，进行保存和扩 繁，培养箱溫度25 + 2 °C，暗培养，每3-4周继代一次。
[0033] 所述的柳枝稷成熟种子为低地型柳枝稷品种Al