作 为对照，剩余的总蛋白加入含FLAGbeads的离屯、管中，放入4°C旋转混匀器中混匀过夜。第 二天2000巧m离屯、2min，除去上清，加入1000 ml洗脱缓冲液，放于4°C冷藏室中摇匀lOmin， 重复洗3遍。200化pm离屯、2min，去除所有洗脱缓冲液只留bleads，加入上样缓冲液煮沸 lOmin，Westernblot检测FLAG和MYC的表达。免疫共沉淀验证了互作关系的存在（图4)。
[0065] 实施例2基于BPMV沉默系统的延伸因子家族基因功能验证
[0066] 本实验室的已有蛋白双向电泳结果显示，Gm邸化在抗病品种中上调表达。而延伸 因子家族的成员往往W复合体的形式存在并发挥作用，因此GmEF化也作为进一步功能分 析的要点。
[0067] 2. 1亚细胞定位和共定位研究
[0068] 把含目的基因的载体热激转化农杆菌，阳性农杆菌菌液用注射器注射到红色巧光 蛋白巧edFlourescentProtein,RFP)细胞核定位转基因本氏烟、RFP内质网定位的转基 因本氏烟中，使目的基因在烟草叶片细胞中瞬时表达。具体步骤同实施例1。注射后的烟 草，在光照培养箱内培养2天左右，使融合巧光蛋白的目的基因在烟草叶片细胞中充分表 达。剪取注射后的新鲜叶肉组织，叶片背部朝上，用无菌水覆盖压片，置于激光共聚焦显微 镜下，选CFP/YFP与RFP的激发波长，观察目的巧光的位置，并与指示巧光位置对比，调至合 适大小拍照。
[0069] 亚细胞定位（图5)显示GmEFla定位在内质网上，少量存在细胞核中。Gm邸化和 P3定位在内质网和细胞核中。。GmEFla和P3的共定位结果（图7)显示，P3存在时GmEFla 定位在除了内质网之外的细胞核内。GmEF化和P3的共定位结果与单独定位没有改变。
[0070] 2. 2细胞核定位信号验证
[0071]制备酵母L40 感受态细胞，分别将pNIA-ca、pNIA-ca-EFla、pNIA-ca-EF化、 pNIA-ca-P3热激转化L40感受态细胞。转化后涂布在SD/-Leu的平板上，29°C倒置于培养 箱培养2天，当平板长出粉色菌落，挑取粉色菌落转移到SD/-His/-Leu平板，29°C培养2-3 天后观察菌落生长情况。细胞核定位信号试验（图6)显示GmEFla、Gn￡F化和P3均含有核 定位信号，与亚细胞定位检测到细胞核内巧光情况吻合。
[0072] 2. 3沉默材料的构建及检测
[0073]将GmEFla的ISObp(L63-G122)和GmEF化的 222bp(L134-P208)分别作为沉默插 入片段构建到BPMV-RNA2载体上，体外转录并接种大豆叶片，成功获得有表型的两个沉默 株系。
[0074] 取第一对S出复叶，提取RNA，合成CDNA第一链，每个样品在96孔板上进行3次重 复，qRT-PCR扩增反应条件：95°C预变性30s，95°C变性5s，60°C退火30s，循环40次，至溶解 曲线分析，待反应结束后，根据2AAET计算CP表达量。qRT-PCR所用引物分别如下：
[00巧]
[0076] qRT-PCR显示GmEFla(图8)和GmEF化（图9)的各拷贝均在各自的沉默株系内被 沉默，且沉默效率较高，适合进行下一步试验。
[0077] 2. 4沉默材料对病毒的抗性反应检测
[0078] 将保存的冻干沉默材料置于研鉢中，加入适量金刚砂和0. 05mol/L憐酸钟缓冲液 (pH7. 2)充分研磨，研磨液接种于供试大豆Essex和Rsvl的对生真叶上，W接种V为对照。 待第一对=出复叶展开并有明显的花叶症状时，分别摩擦接种含G5和G7,W及BYMV的研磨 液。取接种病毒前的叶片为〇化1，作为对照，分别采集4化i和7化i的接种叶片，l(Mpi和 14化i的系统叶片，每份样品采集0. 1-0. 3g于1. 5ml离屯、管中，保存于-80°C冰箱。采样期 间观察并记录不同大豆品种对SMV两个株系的症状反应。
[0079]Westernblot检测病毒含量，将采集的样品在液氮中充分研磨，加入400 GTEN 缓冲液，充分混匀，置于冰上。12, 000g，4°C，离屯、IOmin去除杂质，将上清转移至至新离屯、 管中，置于冰上。利用化a壯ord法测蛋白质浓度，取1-2y1蛋白提取液加入ImlBio-rad 显色试剂中，用分光光度计0D595测吸光值。用BSA制定标准曲线，把样品的吸光值根据标 准曲线，计算出蛋白提取液的浓度，每个样品取等量植物总蛋白20-50yg，加入适量蛋白上 样缓冲液，沸水中煮lOmin，使蛋白变性，用于SDS-PAGE蛋白质电泳。首先制备SDS-PAGE蛋 白胶，其中分离胶为10%，浓缩胶为3. 5%。W100V、120min的电泳条件，分离上述变性蛋 白。电泳结束后，将尼龙膜、胶、滤纸在转膜缓冲液中充分浸泡，依续叠放滤纸、膜、胶、滤纸， 胶和膜之间不能有气泡，否则影响转膜效果。用转膜仪转印，400mA恒电流，120min。转好的 膜，用立春红染色，检测总蛋白浓度。用TBST配制5%脱脂牛奶，将膜室溫封闭比。再将膜 浸在含有一抗（Anti-SMVCP/Anti-BPMVCP/Anti-BYMVCP)的TBST脱脂牛奶中 2h，TBST 漂洗3次，每次IOmin;将漂洗后的膜浸在含有二抗的TBST脱脂牛奶中2h，TBST漂洗3次 后，用HRP-E化发光法显色，标定Marker,并进行分析与扫描。或者用碱性憐酸酶显色法，加 入NBT和BCIP显色底物，直至目的条带清晰。
[0080]表型鉴定发现（图10)，与V相比，在Essex背景下，接种SMVG5后，SHEFla与 SiWF化花叶症状较轻；在Rsvl背景下，接种SMVG7后、SiWFla与SiWF化系统叶没有黄 化和坏死斑的出现。
[00引]Westernblot(图11，12)和化ISA(图13)结果显示在沉默株系的接种叶和系统 叶病毒出现晚并且病毒的积累量明显少，对病毒量的比较发现，与对照相比接种叶片的病 毒减少倍数比系统叶大。运说明沉默GmEFla和GmEF化影响SMV的复制和扩散，但对SMV的 长距离运输没有影响。对沉默GmEFla和GmEF化的植株接种BYMV，Westernblot显示（图 14)与对照相比BYMV表达量没有变化。因此我们推断，SMV在大豆体内的复制和运动依赖 EFla和EF化，并且互作因子对病毒的影响有专一性。
[008引 G7侵染对照植株通常引起低的ROS产生和大量的坏死反应，qRT-PCR对细胞坏死 进行检测，正向引物：ACTCGAAGGGCTGAAACTG，反向引物：GGGTCCATATCCACAGCAATC，qRT-PCR显示（图15)SHEFla和SiWF化植株接种SMV和除草剂后，沉默株系的细胞死亡标记基因 Hsr203j明显少，说明SHEFla和SUEF化能更好的抵抗病原物入侵产生的R0S，同时使植 株表现更少的细胞死亡。
[0083]SMV侵染后的大豆叶片进行密度梯度离屯、，Westernblot检测（图17)发现，在内 质网膜蛋白度ip)出现的位置，可W检测到SMV，说明SMV的存在位置为内质网膜，推断SMV 在内质网膜复制。
[0084] 病毒侵染质体通常引起内质网应激和内质网应激反应的相关基因BIP和NRP的表 达。健康大豆接种G5,qRT-PCR(图17)显示BIP和NRP分别上调8倍和10倍，说明SMV侵 染大豆引起内质网应激。引起应激反应的除了病原物的入侵，实验室条件下还可W用衣霉 素灯M)和二硫苏糖醇值TT)诱导植物产生内质网应激反应。配置IOiiM的衣霉素，DMSO 为对照；4mMDTT，水为对照，分别用抽真空的方式处理健康大豆Essex, -天后接种SMV和 BYMV，Westernblot显示SMV(图18)含量在内质网应激处理后含量明显上升，说明内质网 应激有助于SMV的侵染和复制；而BYMV(图19)的含量没有变化，由于BYMV复制不受在内 质网上，推断SMV复制发生在内质网上，并且引起内质网应激反应需要GmEFla和GmEF化的 参与。
[0085] 从拟南芥突变图库中选取针对转录因子EFla的拟南芥突变体，共购买3个 1'-0臟插入突变体系，分别是记4〇(_050704(：(41'1607930)，54〇(_079753(：(41'1607920)， SALK_063369C (Al'SGeOSgO)，RT-PCR对EFla T-DNA插入S个拟南芥突变体进行鉴定，所需 引物如下：
[0086]
[0087]RT-PCR结果显示（图20)S个突变体敲除了各自的目的基因，而对另外的基因拷 贝没有影响。S个突变体分摩擦接种TCV的体外转录物和CMV病毒粒子，接种叶和上位叶 的Westernblot显示TCV(图21)和CMV(图22)的病毒含量与野生型相比均没有变化。内 质网应激诱导S个突变体，接种TCV(图23)和CMV(图24),Westernblot显示病毒积累量 与野生型没有差别。因此我们推定，突变一个EFla拷贝，对在拟南芥调控TCV和CMV没有 影响，同时由于TCV和CMV的复制均不在内质网，因此推断不在内质网复制的病毒侵染寄主 不引起内质网应激。
【主权项】
1. 大豆延伸因子GmEFla在通过内质网应激调控大豆抗大豆花叶病毒中的应用，其中 所述的大豆延伸因子GmEFla基因序列如SEQIDNO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于沉默所述的大豆延伸因子GmEFla能够提高 宿主对大豆抗大豆花叶病毒的抗病性。3. 沉默大豆延伸因子GmEFla基因的载体在提高植株大豆花叶病毒抗病性中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的沉默大豆延伸因子GmEFla基因的载 体为转入宿主植株能够引起宿主植株中GmEFla基因沉默的载体。5. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的沉默大豆延伸因子GmEFla基因的 载体是将GmEFla基因的一部分片段插入BPMV-RNA2载体所得；优选将SEQIDNO. 3所示的 GmEFla基因的180bp片段插入BPMV-RNA2载体所得。6. 大豆延伸因子GmEFlb在通过内质网应激调控大豆抗大豆花叶病毒中的应用，其中 所述的大豆延伸因子GmEFlb基因序列如SEQIDNO. 2所示。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于沉默所述的大豆延伸因子GmEFlb能够提高 宿主对大豆抗大豆花叶病毒的抗病性。8. 沉默大豆延伸因子GmEFlb基因的载体在提高植株大豆花叶病毒抗病性中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的沉默大豆延伸因子GmEFlb基因的载 体为转入宿主植株能够引起宿主植株中GmEFlb基因沉默的载体。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的沉默大豆延伸因子GmEFlb基因的 载体是将GmEFlb基因的一部分片段插入BPMV-RNA2载体所得；优选将SEQIDNO. 4所示的 GmEFlb基因的222bp片段插入BPMV-RNA2载体所得。
【专利摘要】本发明公开了大豆延伸因子家族在抗大豆花叶病毒中的应用。大豆延伸因子GmEF1a和GmEF1b可在通过内质网应激调控大豆抗大豆花叶病毒中应用。SMV复制发生在内质网上，需要GmEF1a和GmEF1b的参与，SMV的聚集引起内质网应激反应，沉默GmEF1a和GmEF1b会降低内质网应激反应，植株表现更抗病。可见沉默延伸因子家族GmEF1a基因和GmEF1b基因可用于构建抗SMV病毒的转基因植株。且由于这两个基因都源于大豆，因此，对转基因大豆的安全性有进一步提高。
【IPC分类】C12N15/82, A01H5/00, C12N15/29
【公开号】CN105296531
【申请号】CN201510741506
【发明人】栾鹤翔, 智海剑
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月3日