黑果枸杞遗传转化体系建立的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物领域的遗传转化方法，特别设及黑果构杞遗传转化建立的方法及 其应用。
【背景技术】
[0002] 黑果构杞化yciumrutheni州mMurr.)是茄科构杞属的一种带刺野生灌木，株高 约20~50cm，主要分布于山西北部、宁夏、甘肃、青海、新疆、西藏等荒漠地区，呈片状丛生 分布，对盐溃化±壤具有很强的适应能力。目前对于黑果构杞的研究主要集中在果实营养 成分、药用成分、色素和多糖提取工艺及药理分析方面，还未见有关于黑果构杞遗传转化体 系建立的报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供黑果构杞遗传转化体系建立的方法。
[0004] 本发明所提供的黑果构杞遗传转化建立的方法，包括如下步骤： 阳0化](1)将含有目的DNA的质粒导入农杆菌得到重组农杆菌；将所述重组农杆菌在含 有卡那霉素化anamycin，Kan)的LB液体培养基中于28°C振荡培养24-36小时；
[0006] (2)取所述步骤（1)的菌液于含有卡那霉素的LB液体培养基中，28°C振荡培养至 ODeoo值为0. 5-0. 7,离屯、收集菌体； 阳007] (3)用LB液体培养基重悬所述步骤（2)收集的菌体，28°C继续振荡培养至菌液 ODe。。值分别为0. 5、0. 6和0. 7,用作侵染液；
[000引 （4)用所述步骤做的侵染液浸泡黑果构杞外植体10-30分钟，得到侵染后的黑果 构杞外植体；
[0009] (5)将所述步骤（4)得到的侵染后的黑果构杞外植体放置于共培养培养基上于黑 暗中共培养2-4天，得到共培养物；
[0010] (6)将所述步骤（5)得到的共培养物用含有500mg/L头抱霉素（Cefotaxime,Cef) 的无菌水清洗后转移至含有20mg/L卡那霉素和300mg/L头抱霉素的愈伤组织诱导及筛选 培养基上培养10-14天，得到去除农杆菌后的愈伤组织；
[0011] (7)将所述步骤（6)得到的去除农杆菌后的愈伤组织在头抱霉素浓度递减的愈伤 组织诱导及筛选培养基上培养2-3周，得到抗性愈伤组织；
[0012] (8)将所述步骤（7)得到的抗性愈伤组织转入选择和分化培养基上培养6-8周，得 到丛生牙；
[0013] (9)将所述步骤（8)得到的丛生芽在生根诱导培养基上诱导生根，即得到黑果构 杞的抗性再生苗。
[0014] 所述步骤（1)中含有卡那霉素的LB液体培养基中各成分的浓度为：卡那霉素 5〇111邑/1、膜蛋白腺lOg/l、酵母提取物5g/L和氯化钢lOg/L。
[0015] 所述步骤（2)中含有卡那霉素的LB液体培养基中各成分的浓度为：卡那霉素 5〇111邑/1、膜蛋白腺lOg/l、酵母提取物5g/L和氯化钢lOg/L。
[0016] 所述步骤（3)中所述菌液的ODe。。值为0. 6。
[0017] 所述步骤（4)中，所述黑果构杞外植体为黑果构杞叶片；所述浸泡时间为20分钟。
[0018] 所述步骤（5)中所述共培养培养基为：MS基本培养基，附加30g/L薦糖、6.Og/L琼 脂粉和 0. 2mg/L2, 4-D。
[0019] 所述步骤化）中所述愈伤组织诱导及筛选培养基为：MS基本培养基，附加30g/L 薦糖、6.Og/L琼脂粉、0. 2mg/L2, 4-D、20mg/L卡那霉素和300mg/L头抱霉素。
[0020] 所述步骤（8)中所述选择和分化培养基为：MS基本培养基，附加30g/L薦糖、 6.Og/L琼脂粉、2.Omg/L6-BA、20mg/L卡那霉素和150mg/L头抱霉素。
[0021] 所述步骤巧）中所述生根诱导培养基为：MS基本培养基，附加30g/L薦糖、6.Og/L 琼脂粉和0. 2mg/La-糞乙酸。
[0022] 所述建立黑果构杞遗传转化体系的方法在获得黑果构杞转基因材料中的应用也 属于本发明的保护范围。
[0023] 本发明所提供的黑果构杞的遗传转化方法，操作简单易行，转化后得到的愈伤组 织存活率高，可为黑果构杞的基因工程研究和分子育种提供材料。
【附图说明】 W24] 图1为质粒提取检测结果；泳道1-4 :质粒祀T2化；泳道M: 10化PplusDNA IadderD 阳02引 图2为N址G基因高保真PCR结果；泳道1和2 :N址G条带；泳道M:IOObp DNA ladder。
[0026] 图3为目的基因和载体双酶切；泳道1 :N址G基因双酶切；泳道2 :载体地1121双 酶切；泳道M=IOObpDNA ladder。
[0027] 图4为利用M13F/R引物进行Transl-Tl菌液PCR的结果；泳道1和2:NahG条带； 泳道M:DLlOOODNAladder。 阳02引 图5为携带有N址G的GV3101菌液PCR检测结果；泳道1和2:N址G条带；泳道 M:IOObpplusDNAladder。
[0029] 图6为真核表达载体构建示意图。
[0030] 图7为黑果构杞叶片Kan耐性试验；其中，图7中a:A:对照，B:50mg/LKan， C:100mg/LKan，D:200mg/LKan;图 7 中b:A:10mg/LKan，B:20mg/LKan，C:对照，D:30mg/ LKan，E:50mg/LKan。
[0031] 图8为黑果构杞遗传转化获得抗性再生苗的过程;A:外植体侵染后产生的愈伤组 织，B:愈伤组织在筛选培养基上分化，C:分化的抗性丛生芽，D:生根的抗性再生植株。
【具体实施方式】
[0032] 实施例1、建立黑果构杞遗传转化体系
[0033] 一、真核表达载体的构建
[0034] 1、目的基因N址G的获得 阳0对 （1)质粒提取
[0036] 含有载体阳T2化-N址G的E.coli菌株D册a由中国人民武装警察部队 后勤学院（天津市职业与环境危害防制重点实验室）赵化冰老师惠赠。NahG基因 (AY20891ND09189257-90561)来自糞降解菌株PseudomonasSP.ND6 狂haoetal. 2005)。将 D册a(pET21b-N址G)接种至LB液体培养基，37°C，200巧m/min振荡培养过夜，使用天根质 粒小提试剂盒（TIANprepMiniPlasmidKit)提取质粒，方法如下：
[0037] 1.向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500yL的平衡液化，12, 00化pm 离屯、Imin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，平衡吸附柱；
[0038] 2.取l-5mL过夜培养的菌液，加入离屯、管中，使用常规台式离屯、机，12, 00化pm离 屯、Imin,尽量吸除上清；
[0039] 3.向留有菌体沉淀的离屯、管中加入250yL溶液Pl(使用前加入RNaseA)，满旋 振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
[0040] 4.向离屯、管中加入250yL溶液P2,溫和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；
[0041] 5.向离屯、管中加入350yL溶液P3,立即溫和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时 将出现白色絮状沉淀，12, 00化pm离屯、IOmin;
[0042] 6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管 中），12,O(K)巧m离屯、30-60S，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；
[0043] 7.向吸附柱CP3中加入600yL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇），12, 00化pm离 屯、30-60S，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中； W44] 8.重复操作步骤7 ; 阳045] 9.将吸附柱CP3放入收集管中，12, 00化pm离屯、2min，将吸附柱中残余的漂洗液 去除。将吸附柱CP3开盖，置于室溫放置数分钟，W彻底惊干吸附材料中残余的漂洗液；
[0046] 10.将吸附柱CP3置于一个干净的离屯、管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100yL 洗脱缓冲液邸，室溫放置2min，12, 00化pm离屯、2min，将质粒溶液收集到离屯、管中。
[0047] 将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1。 W48] 0)引物设计、合成及PCR法扩增目的基因N址G
[0049] 用PrimerPremie巧软件设计引物，并添加与表达载体相应的限制性内切酶酶切 位点，由生工（SangonBiotec)合成，最终引物序列如下： 阳0加]NG-F5, -CGCGGATCCATGAAAAACAATAAACC-3'
[0051]NG-R5, -CCAATCTCGAGCCCTTGACGTAGCAC-3，
[0052] 其中下划线部分为BamHI酶切位点，斜体部分为化Ol酶切位点。W提取的质粒载 体祀T2化为模板，用高保真DNA聚合酶Pyrobest进行PCR，获取目的基因N址G，50yL反应 体系如下：
[0053]
[0056] PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。
[0057] 用化ansgen DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段，方法如下： 阳化引1.紫外灯下切取含DNA片段的琼脂糖凝胶，放入1. 5血离屯、管内；
[0059] 2.加入3倍凝胶体积的溶胶液GSB，55°C水浴直至凝胶完全溶化； W60] 3.溶胶冷却至室溫后转移到DNA吸附管离屯、柱中，静置Imin;
[0061] 4. 12, 000巧m，离屯、30 - 60s;弃流出液； 阳06引5.加入650yL漂洗液WB，12, 000巧m，离屯、30 - 60s，弃流出液；
[0063] 6.000巧m，空离屯、2min，去除残留WB; W64] 7.将吸附柱开盖于超净工作台2min，使WB完全挥发； W65] 8.加入30-50yL洗脱液TE,室溫静置Imin;吸附柱放入新的1. 5血离屯、管；
[0066] 9. 12, 000巧m，离屯、2min，置于-20°C保存备用。
[0067] (3)PCR产物序列测定 W側测定了 3个阳性单克隆，其序列完全一致，与已发表的N址G序列有2个碱基的差 异，即43位和609位（identity= 99. 58% )，可W认为扩增得到的基因即为N址G。
[0069] (4)目的基因与表达载体酶切、回收与连接
[0070] 将地1121质粒与N址G(连接至祀ASY-T3载体）分别用限制性内切酶BamHI和 化Ol进行双酶切，20yL酶切体系：
[0071] 加H?0 10.8 |j.L IOxBuITcrD 2.0 uL. BSA (K)Mg-Vl) 0.2 mL DNA 6.0 uL 公"";H! (10U.VL) 0.5 !_止 A7wl(iOU4iU 0.5 |.iL 37°C反应 4h。
[0072] 双酶切结果见图3。
[0073] 琼脂糖凝胶电泳分离并切取所需DM片段，用DM胶回收试剂盒回收产物，方法同 上。将回收片段用TaDNA连接酶连接，10yL连接体系：
[0074] T.4 10<Bu(Tor 1jiL NahG片段 5呼 pBU21大片段 3jxL 74IJgasc(350U/pL)IjiL 16 "C反应过夜。
[0075] 3、连接产物扩增及序列测定
[0076] 利用热激法将连接产物转化至50JiL大肠杆菌感受态细胞Transl-Tl,涂布卡那 霉素抗性选择培养基平板（LB固体培养基巧Omg/LKan)。挑取阳性单菌落，接种至LB液体 培养基，37°C，200rpm/min振荡培养14h，提取质粒并测序。
[0077] 菌液PCR法鉴定阳性克隆，15 y L体系如下：
[0078] 2XPCRMix 7 5|_iL .VG--F(IO^M) 化 6[iL (IOliM) 0.6LiL 菌液 I.OiaL 加H2O 5.3