小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法与流程

本发明涉及细胞工程中真菌原生质体制备与再生技术领域，具体涉及一种小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法。

背景技术：

小麦光腥黑粉菌(tilletiafoetidawalle.lindr.)引起的小麦光腥黑穗病(commonbuntofwheat)是一种世界性病害，具有分布广泛、流行性强，危害严重等特点，严重影响小麦的生产。感病植株通常在外观上没有明显的症状，在发病后期，颖壳略向外张开，整个麦穗变成病穗，病粒外有一层灰色薄膜，内部充满黑粉，是病原菌的冬孢子，冬孢子有鱼腥味，引起小麦产量和品质降低。小麦光腥黑粉菌属于担子菌亚门(basidiomycotina)、冬孢菌纲(teliomycetes)、黑粉菌目(ustilaginales)、腥黑粉菌科(tilletiaceae)、腥黑粉菌属(tilletia)。冬孢子呈褐色，球形或近球形，可随种子传播，在土壤中能够存活多年，一旦条件适宜并遇到大面积的寄主植物，便会引起发病。

国内外对于小麦光腥黑穗病的研究主要集中在病原菌生物学特性以及分子标记技术，对该病原菌的致病机制研究较少。遗传转化技术是实现大规模定点突变的重要方法，利用该技术能够改变真菌的遗传物质，研究植物病原菌的的致病机理。目前，真菌遗传转化的方法有很多，常见的有聚乙二醇介导的原生质体转化、限制性内切酶介导的整合以及农杆菌转化等。原生质体是大多数转化方法的受体细胞，因此原生质体的制备和再生直接关系到转化能否顺利进行。获得产率高、可再生的小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，将为建立该病原菌的遗传转化体系奠定基础，推动对该病原菌致病机制的研究。

技术实现要素：

针对上述领域存在的需求，本发明的目的在于提供一种小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法。

本发明通过如下技术方案实现：

小麦光腥黑粉菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)菌丝培养：将小麦光腥黑粉菌的冬孢子在水琼脂培养基中培养6-9天后，用灭菌蒸馏水冲洗下来，收集菌液，离心去上清，得到菌丝；

(2)细胞壁裂解：以氯化钾溶液作为渗透压稳定剂，配制混合酶液，加入菌丝中，28℃振荡酶解1.5-2.5h，即得到小麦光腥黑粉菌原生质体；

所述混合酶液包括质量百分比浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶。

优选地，所述水琼脂培养基的制备方法为：称取20g琼脂粉，加水定容到1l，高压蒸汽灭菌。

优选地，所述小麦光腥黑粉菌冬孢子在水琼脂培养基中培养7天。

优选地，所述氯化钾溶液的浓度为1.2mol/l。

优选地，所述28℃振荡酶解的时间为2h。

优选地，所述混合酶液与所述菌丝的配比为20ml：1g。

优选地，所述振荡酶解在180r/min的转速下进行。

优选地，所述小麦光腥黑粉菌的冬孢子在水琼脂培养基中培养的条件为温度为16℃和相对湿度为80％。

原生质体是许多真菌进行遗传转化的受体细胞，优化原生质体的制备方法，能更好的建立小麦光腥黑粉菌的遗传转化体系。本发明以小麦光腥黑粉菌菌株为供试材料，研究了菌株培养时间、细胞壁裂解酶、酶解时间和渗透压稳定剂等对原生质体制备的影响，获得了小麦光腥黑粉菌原生质体制备的最佳条件。

菌龄：制备真菌的原生质体一般都采用新鲜的菌丝或孢子，细胞壁的结构和成分在不同的生长时期会有所不同。小麦光腥黑粉菌冬孢子萌发后先产生先菌丝和初生担孢子，之后初生担孢子h结合产生侵染菌丝，侵染菌丝既对小麦有侵染性，又容易被酶解。培养时间过短，产生的先菌丝和担孢子相对比较幼嫩，在原生质体释放后容易受到酶的作用而破裂，降低原生质体得率；培养时间过长，菌丝细胞壁老化、成分改变，酶系统对其作用不显著，原生质体得率较低。因此，小麦光腥黑粉菌冬孢子的培养时间直接影响原生质体数量。本发明实验结果表明，在水琼脂培养基中培养7天的小麦光腥黑粉菌最适宜制备原生质体，产生的原生质体数量最多。

裂解酶及酶解时间：真菌细胞壁成分复杂多样，在原生质体制备中，用于裂解细胞壁的酶的种类及酶解时间，对原生质体产出率有非常重要的影响。酶解时间过短，细胞壁破解不完全，许多原生质体不能从菌丝上分离下来，使原生质体产率降低；时间过长，酶对得到的原生质膜伤害作用过大，容易造成原生质体的破裂，也会降低原生质体的产率。担子菌菌丝的细胞壁主要成分是几丁质和葡聚糖。本发明采用崩溃酶、溶壁酶和蜗牛酶对小麦光腥黑粉菌细胞壁进行溶解实验，其中崩溃酶是含有木聚糖酶、昆布多糖酶、及纤维素酶等的复合酶；溶壁酶具有几丁质酶、纤维素酶及蛋白酶等活性；蜗牛酶中含有纤维素酶、果胶酶、葡糖酸酶、几丁质酶和脂酶等多种酶。结果表明，一种酶或者两种酶都不能很好地溶解小麦光腥黑粉菌细胞壁，本发明采用质量浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶的复合酶液，在28℃振荡条件下对菌体细胞壁酶解2h后，获得的原生质体产率最高。

渗透压稳定剂：渗透压稳定剂可以保护细胞膜使其不受裂解酶过度破坏，对原生质体起到保护作用，能影响原生质体的制备和再生。渗透压稳定剂通常包括有机和无机两种，针对不同的真菌，作用效果不同。本发明研究发现，以1.2mol/l的kcl为渗透压稳定剂，所得的小麦光腥黑粉菌原生质体数量最多，且释放的原生质体能够均匀散乱分布，不聚集成堆。

综上，采用本发明的方法制备小麦光腥黑粉菌原生质体，产量高达17.0×10⁵～18.0×10⁵个/ml，且释放的原生质体均匀散乱分布，不聚集成堆。得到的原生质体可以在tb3培养基上长出较多单菌落，可用于小麦光腥黑粉菌的原生质体再生。

附图说明

图1为小麦光腥黑粉菌原生质体的释放过程，

其中，a：在酶解初始阶段，菌丝细胞开始向内凹陷成念珠状；b：随着酶解进行，细胞壁逐渐被降解，原生质体释放出来，呈圆形透明的小球；c：有的原生质体会连在一起；d：最后菌丝酶解完全，大量的原生质体释放出来。

图2为菌龄对原生质体形成的影响，

其中，横坐标为菌体的培养天数，纵坐标为原生质体数量(×10⁵个/ml)。

图3为不同酶解时间对原生质体产量的影响，

其中，横坐标为酶解时间(小时)，纵坐标为原生质体数量(×10⁵个/ml)。

图4为不同渗透压稳定剂对原生质体产量的影响，

其中，横坐标为不同的渗透压稳定剂，纵坐标为原生质体数量(×10⁵个/ml)。

图5为使用不同渗透压稳定剂制备的原生质体释放后的状态，

其中，a：以山梨醇作为渗透压稳定剂，所释放的原生质体易聚集分布，箭头所示为原生质体；b：以蔗糖为渗透压稳定剂，很多原生质体聚集在一起，箭头所示为原生质体；c：以mgso4为渗透压稳定剂，原生质体释放后分散分布，箭头所示为原生质体；d：以kcl为渗透压稳定剂，原生质体释放后分散分布，箭头所示为原生质体。

图6为小麦光腥黑粉菌原生质体的再生，

其中，左侧为tb3培养基，右侧为pda培养基。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

生物材料

小麦光腥黑粉菌：本发明所使用的小麦光腥黑粉菌为现有文献《小麦光腥黑穗菌萌发的超微结构研究》，西北农业大学学报，1999，03期(3)：110-112所记载的菌株。

上述生物材料本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。

主要试剂

溶壁酶(lysingenzyme)，购于sigma公司，货号：sigml1412；

崩溃酶(driselase)，购于sigma公司，货号：d9515；

蜗牛酶(snailase)，购于上海生化所，货号：d2412；

pda粉末，购于北京奥博星生物技术有限责任公司，货号：02-023；

硫酸镁，购于北京化工厂，货号：34156-69-9；

氯化钾，购于国药集团化学试剂有限公司，货号：7447-40-7；

山梨醇，购于amresco公司，货号：0691-500g；

蔗糖，购于国药集团化学试剂有限公司，货号：57-50-1。

培养基

2％水琼脂培养基制备方法：称取20g琼脂粉，加水定容到1l，121℃高压蒸汽灭菌。

马铃薯葡萄糖固体培养基(pda)：称取pda粉末37g，加水定容到1l，121℃高压蒸汽灭菌。

tb3培养基：酵母提取物3g，酸水解酪蛋白3g，蔗糖200g，酵母粉10g，加水定容到1l，121℃高压蒸汽灭菌。

下述实施例中未特别说明的生物化学试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得，规格为实验室纯级。

实施例1：小麦光腥黑粉菌原生质体制备方法的优化

将小麦光腥黑粉菌的冬孢子在2％的水琼脂培养基中培养，温度16℃，相对湿度为80％，选取不同培养天数的菌体用灭菌蒸馏水冲洗下来，收集菌液并过滤，5000r/min离心10min去上清，取1g菌丝，分别加入20ml不同种类的复合酶液，28℃，180r/min振荡酶解，每隔半小时用血球计数板观察原生质体得率，筛选出最适宜原生质体制备的菌龄、酶解时间、酶解体系、渗透压稳定剂。

1、菌体培养时间

在水琼脂培养基上培养小麦光腥黑粉菌的冬孢子，温度16℃，相对湿度为80％，4d后开始萌发长出先菌丝，5d后先菌丝上长出初生担孢子，初生担孢子h型融合，之后长出侵染丝和次生担孢子。选取不同生长阶段(6d、7d、8d、9d)的菌体，用灭菌蒸馏水冲洗下来，过滤，5000r/min离心10min去上清，取1g菌丝，加入20ml用1.2m氯化钾溶液配制的质量浓度为1.5％崩溃酶，1.5％溶壁酶和1.5％蜗牛酶的复合酶液，28℃，180r/min振荡酶解1.5h，观察并记录原生质体获得量，选出最适宜制备原生质体的菌体培养时间。

试验结果如图2所示，培养7d后的侵染菌丝用作初始材料进行酶解，比较容易得到原生质体，且酶解相同时间后得到的原生质体数量最多，为17.0×10⁵个/ml。

2、细胞壁裂解酶

用1.2m的氯化钾溶液分别配制质量浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶，研究单一酶和不同组合的酶液对小麦光腥黑粉菌原生质体产量的影响。

在水琼脂培养基上培养小麦光腥黑粉菌的冬孢子，温度16℃，相对湿度为80％，选取培养8天的菌丝，用灭菌蒸馏水冲洗下来，收集菌液并过滤，5000r/min离心10min去上清，取1g菌丝，分别加入20ml单种酶和不同组合的酶液，28℃，180r/min振荡酶解1.5h，观察并记录原生质体获得量。

结果如表1所示，原生质体的产量受细胞壁裂解酶的种类和浓度的影响较大，且混合酶的作用效率高于单一酶。在单个酶作用时，1.5％的崩溃酶得到的小麦光腥黑粉菌的原生质体数量最多，为3.2×10⁵个/ml；1.5％的蜗牛酶得到的原生质体数量最少，为2.4×10⁵个/ml；两种酶组合时，原生质体的数量与单种酶相比有所提高；三种酶混合时，得到的原生质体最多。因此，在小麦光腥黑粉菌原生质体的制备中，选择崩溃酶、溶壁酶和蜗牛酶三种酶混合效果较好。

表1不同裂解酶组合对小麦光腥黑粉菌原生质体产量的影响

不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。

3、酶解时间

酶解时间影响原生质体的获得率和再生，因此确定合适的酶解时间至关重要。用1.2m的氯化钾溶液配制质量浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶的复合酶液，备用。

在水琼脂培养基上培养小麦光腥黑粉菌的冬孢子，温度16℃，相对湿度为80％，选取培养8天的菌丝，用灭菌蒸馏水冲洗下来，收集菌液并过滤，5000r/min离心10min去上清，取1g菌丝，加入20ml配制好的复合酶液，28℃摇床中180r/min振荡酶解，设置酶解时间分别为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5、3h，显微镜检观察是否获得原生质体以及原生质体的数量。

结果如图3所示，在酶解0.5h时原生质体数量较少，很多菌丝的细胞壁虽然被不同程度的破坏，但大多数还没有破解完全，原生质体还没有从菌丝上分离下来；之后随着酶解时间的增加，原生质体的数量也增加，2h时达到最大值，为17.6×10⁵个/ml；继续酶解，原生质体的数量减少。

4、渗透压稳定剂

本实验分别选择1.2mol/l的mgso4、kcl、d-山梨醇、蔗糖作为渗透压稳定剂，观察不同渗透压稳定剂对小麦光腥黑粉菌原生质体制备的影响。

在水琼脂培养基上培养小麦光腥黑粉菌的冬孢子，温度16℃，相对湿度为80％，选取培养8天的菌丝，用灭菌蒸馏水冲洗下来，收集菌液并过滤，5000r/min离心10min去上清，取1g菌丝，分别加入20ml不同渗透压稳定剂配制的质量浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶的复合酶液，28℃摇床中180r/min振荡酶解1.5h，记录原生质体的数量。

如图4和图5所示，不同类型的渗透压稳定剂对原生质体制备的影响不同，在所选的四中渗透压稳定剂中，相同条件的处理下，无机溶剂比有机溶剂原生质体得率更高，且以山梨醇和蔗糖作为渗透压稳定剂所得到的原生质体易聚集，采用氯化钾作为渗透压稳定剂，得到原生质体最多，为12.1×10⁵个/ml，且原生质体不会聚集成堆。

实施例2：采用优化后的方法制备小麦光腥黑粉菌原生质体

用1.2mol/l的氯化钾配制质量浓度为1.5％的崩溃酶、1.5％的溶壁酶和1.5％的蜗牛酶的复合酶液。然后按照如下步骤制备原生质体：

(1)菌丝培养：在2％水琼脂培养基上培养小麦光腥黑粉菌的冬孢子7d，培养条件为温度16℃，相对湿度80％，然后将萌发的冬孢子用灭菌蒸馏水冲洗下来后，收集菌液。

(2)酶解菌丝细胞壁：将收集的菌液过滤，然后5000r/min离心10min去上清，取1g菌丝，加入20ml复合酶液，28℃，180r/min，振荡酶解2h，将酶解液过滤，5000r/min离心10min，即得到小麦光腥黑粉菌原生质体。

结果表明，采用本发明优化的方法制备小麦光腥黑粉菌原生质体，原生质体得率可达到17.0×10⁵～18.0×10⁵个/ml。

小麦光腥黑粉菌原生质体的释放过程如图1所示，在酶解初始阶段，菌丝细胞开始向内凹陷成念珠状(图中1a)，随着酶解进行，细胞壁逐渐被降解，原生质体释放出来，呈圆形透明的小球(图1中b),有的原生质体会连在一起(图1中c)，最后菌丝酶解完全，大量的原生质体释放出来(图1中d)，成游离状态，均匀分散。

实施例3：小麦光腥黑粉菌原生质体的再生

将实施例1和2制备得到的原生质体分别用1.2mol/l的氯化钾重新悬浮后，分别涂布在pda和tb3固体培养基中，16℃培养4天，观察长出的单菌落。

结果如图6所示，小麦光腥黑粉菌的原生质体在tb3培养基上长出较多单菌落，而pda培养基上无单菌落长出，因此，tb3培养基比pda培养基更适合原生质体再生，可用于小麦光腥黑粉菌原生质体的再生培养。