全正确的AtTHIl基因序列。
[0036]通过酶切组合Bamh I /Sac I将AtTHIl核苷酸序列从Blunt载体中切下，再次胶回收并连接到植物表达载体PSTART中。
[0037]3，转基因植株的筛选和获得
[0038]连接正确的植物表达载体pSTART-THIl转化农杆菌EHA105，通过农杆菌浸染的方法进行转基因操作，转入野生型植株，获得过表达植株。具体实施方法如下:
[0039]农杆菌感受态转化步骤:
[0040]1) _80°C冰箱中取出农杆菌感受态细胞，冰浴融化，加入目的质粒DNA，轻弹均匀，冰浴30分钟；
[0041 ] 2)冰浴结束后，液氮速冻1分钟，紧接着37 °C水浴3-5分钟；
[0042]3)加入500 μ 1无抗生素LB液体培养基，28°C、振荡培养2_4小时；
[0043]4)培养结束后收集菌体，100 μ 1 LB液体培养基重悬，菌液涂布在YEP固体培养基(添加相应抗生素)，28°C倒置培养2-3天；
[0044]5)挑取单克隆菌斑做菌落PCR鉴定。
[0045]农杆菌浸染拟南芥:培养约4周的抽薹拟南芥，将已经开放的花剪去。将已转化目的基因的农杆菌菌液在转化前一天放大培养(按照2%接种)，28°C振荡培养过夜。摇培至0D6QQ= 1.0-1.2后，6000rpm离心15分钟收集菌体，用转化介质将菌液稀释至0D 600 =
0.8-0.9，加入Sillwet至终浓度为0.02%。将花盆倒置，花序浸入转染液中20秒，之后将花盆水平放置，在黑暗中培养24小时。之后在22°C，长日照(16小时光照，8小时黑暗)培养，收取种子。通过抗性筛选标记和PCR鉴定得到阳性转基因植株。
[0046]实施例3拟南芥AtTHIl的转基因应用
[0047]利用获得的AtTHIl突变体(CS3573，CS3590)、过表达植株(命名为THI1-0E-8，THI1-0E-14)、进行下面生理性状实验，分析AtTHI在拟南芥或其他经济作物中在生长发育和调控气孔运动及植物抗干旱方面的应用。
[0048]1，拟南芥培养
[0049]本操作以野生型植株(Col-0)、AtTHIl突变体(CS3573，CS3590)为操作对象，分别设定对照组(无VB1添加)和实验组(添加VB1)。对照组在正常条件下培养，实验组则每周对植物添加ImM的VB1溶液1ml，然后观察植物生长状态。
[0050]将以上植株种子放入1.5ml离心管中，超净台内用75%乙醇表面消毒3_5分钟，然后再用95%乙醇清洗1分钟，将种子转移到灭菌的滤纸上干燥，随后播种到1/2MS培养基上。4°C黑暗48小时进行低温处理，然后转移到22°C，16小时光照(22°C )/8小时黑暗(18°C )的循环条件下培养。培养约1周后，转移到填充营养土(营养土与蛭石为体积比为2:1)的生长钵中生长。
[0051]结果如图1所示，AtTHIl突变体(CS3573，CS3590)的正常生长需要外源添加VB1，说明AtTHIl参与植物体内VB1的合成，对植物的生长发育具有重要的作用。
[0052]2，外源ΑΒΑ促进气孔关闭实验
[0053]本操作以野生型植株(Col-0)、AtTHIl过表达植株(命名为THI1-0E-8，THI1-0E-14)四周左右莲座叶为操作对象，分别设定对照组(加等体积无水乙醇处理)和实验组(加不同浓度ΑΒΑ处理)。
[0054]1)剪取生长四周的拟南芥莲座叶，放在Closure Buffer (20mM KCl，lmM CaCl2，5mMMes-KOH，pH 6.15)中，下表皮接触 Buffer，室温光照培养(450mol.mis1)；
[0055]2) 2.5小时后，加ΑΒΑ (脱落酸)到Closure Buffer中，终浓度为0-50 μ Μ，继续光照处理；
[0056]3) 2.5小时后，撕取叶片下表皮，制作水压片，显微镜400放大倍数下拍照；
[0057]4)用统计软件ImageJ统计气孔开度。
[0058]气孔运动实验结果如图2-B所示，对照条件下，各植株之间气孔开度无差异；但在ΑΒΑ处理条件下，AtTHI过表达植株(THI1-0E-8、THI1-0E-14)气孔开度比野生型(Col_0)小，对ΑΒΑ的作用过敏感。说明在植物气孔运动方面，AtTHIl具有很大的应用价值。
[0059]3，拟南芥离体叶片失水率实验
[0060]生长四周左右的植株，选取生长健壮的莲座叶，剪取，放在温室条件下进行失水实验，分别在0、60、120、180分钟称量叶片重量，按照下面公式计算叶片失水率:
[0061]叶片失水率％ = (0分钟重量-X分钟重量)/0分钟重量X 100
[0062]离体叶片失水结果如图2-C所示，同样条件下，统计各转基因植株的离体叶片失水率。与野生型(Col-Ο)和相比，AtTHIl过表达植株失水较慢。
[0063]3，拟南芥植株干旱实验
[0064]本操作以野生型植株(Col-0)、AtTHIl过表达植株(命名为THI1-0E-8，THI1-0E-14)为操作对象。
[0065]生长2周的植株，充分浇水后，停止浇水。在温室干旱处理，植株开始萎蔫至死亡时进行复水，3天后观察植株存活状态。在干旱处理后和复水3天后分别拍照。
[0066]植株干旱实验结果如图3所示，干旱处理下，与野生型(Col-Ο)对比，AtTHIl过表达植株(THI1-0E-8，THI1-0E-14)抗干旱能力增强。说明AtTHIl在植物抗干旱胁迫应答中起到重要的调节作用，在培育抗旱作物新品种方面有潜在的应用价值。
【主权项】
1.拟南芥硫胺素B1(VB1)合成酶基因AtTHIl在植物生长发育和调控气孔运动及抗干旱中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述植物是十字花科植物。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述十字花科植物是芥菜、油菜、白菜或甘蓝。
【专利摘要】本发明公开了一种拟南芥硫胺素B1合成酶基因AtTHI1在植物生长发育和调控气孔运动及抗干旱中的应用。经对其的综合实验证实：AtTHI1的正常表达对植物的生长发育必不可少；同时，AtTHI1的过表达降低植物对脱落酸(ABA)促进气孔关闭过程的敏感性，使转基因植株的离体叶片失水率降低，抗干旱能力增强。预示本发明的应用将有助于改良植物的抗旱胁迫能力，对培育抗旱高产的作物新品种有重要的理论指导意义，对我国农业生产具有巨大应用价值。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/53, A01H5/00
【公开号】CN105296533
【申请号】CN201510868167
【发明人】张伟, 李春龙, 王美, 沈建霖, 陈冬花
【申请人】山东大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月1日