一种表达人类胰淀素的蔬菜瓜果的培育方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及一种表达人类膜淀素的蔬菜瓜果的培育方法 及其应用。
【背景技术】
[0002] 糖尿病值M)是内分泌与代谢失常导致的常见慢性病。2011年，全球约有3. 66亿 DM患者，死亡人数高达460万，经济损失高达4650亿美元；至2030年，人数将升高到5. 52 亿。2007 - 2008年我国全国调查结果显示，DM患病率高达9. 6%，总患者数约为9200万 人。更甚者，DM前期糖耐量减低（IGT)/空腹血糖受损（IFG)的患病率已高达15. 5%，推算 出全国DM前期的患者数约为1. 48亿人。通过与W往的调查数据相比，青中年人群患病的 人数增加得更为明显。在城市中，无论经济水平发达与否，DM患病率均超过10% ;且DM前 期人群无城乡差别。
[0003]目前膜岛素是被广泛用于DM的临床治疗的常规药物。膜岛素由膜腺膜岛0细胞 分泌，是机体内唯一降低血糖的经典激素，同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成。外源性膜岛素 主要用来治疗DM，而DM患者早期使用膜岛素和超强抗氧化剂如注射用硫辛酸、口服邮青素 等。膜岛素因其促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原的分解和糖原异生，故而 容易出现低血糖的不良反应；其次，注射膜岛素会产生疼痛感，长期反复在相同相近部位注 射膜岛素刺激皮下脂肪增生而形成脂肪垫；而且，注射膜岛素的部位可出现皮下脂肪萎缩， 形成不易察觉的小凹陷。更令医生和病人担屯、的是，注射膜岛素一段时间后，不仅会造成膜 岛素抵抗，需要不断加大膜岛素剂量；而且病人体重增加，导致向屯、性肥胖，增加屯、脑血管 病风险。膜岛素作用过程设及水与电解质的平衡（促进钟离子和儀离子穿过细胞膜进入细 胞内），所W还容易引起膜岛素性水肿、膜岛素过敏反应等。所W虽然注射膜岛素可W快速 降糖，商品化与临床应用也得到大范围的推广，但其固有缺陷与长期使用后的风险也成为 了医学界关注的焦点。
[0004] 我们通过前瞻性研究观察华人2型DM2906例（其中膜岛素治疗971例），连续 随访7年。横断面资料研究中美国2型DM25964例，英国2型DM84622例。死亡、癌症、 慢性并发症、低血糖与危症是主要临床终点。结果发现膜岛素治疗显著增加2型DM临床终 点事件风险。注射膜岛素虽可快速降糖，膜岛素商品化和膜岛素治疗得到临床推广，然而膜 岛素治疗的系统风险也成为医学界关注的焦点问题。目前DM人群还在迅速扩大，膜岛素使 用者并发癌症、冠屯、病、脑中风、慢性肾病、低血糖的风险不断攀升。（牟学晶；任欣欣；赵海 漉.膜岛素治疗的系统风险.临床合理用药杂志2014 ;7 (7B) : 12-14.)
[0005] 人类膜淀素化IAP巧又称膜淀素（Amylin)，于1987年由瑞典病理学家Westermark P和新西兰学者CooperGJ从人膜岛素瘤和2型DM膜腺组织中发现。[Cooperetal.，1987; Westermarketal.，1987]人膜淀素化umanIAPP，hIAP巧由37个氨基酸组成，分子中第 二和第屯位半脫氨酸残基之间形成二硫键，径基末端酷胺化，中间第20 - 29位氨基酸组 成具有种属差异性，与致淀粉样变能力密切相关。电镜和免疫组化染色显示，膜淀素与膜岛 素共存于成人膜岛P细胞内。正常人膜腺组织中含有与膜岛素相当数量的hIAPP阳性细 胞，血液中hIAPP含量也与血膜岛素水平密切相关。1型糖尿病病人膜腺组织内和血液里 几乎检测不到hIAPP;膜岛素抵抗和高膜岛素血症的患者，hIAPP的含量也高；需要膜岛素 控制血糖的2型DM病人膜腺组织内和血液里的hIAPP水平低下。hIAPP是膜岛淀粉样变 的主要组分，膜岛淀粉样变又是人类2型DM的病理特征。加之hIAPP有调节糖代谢和膜岛 素、膜高血糖素等相关激素分泌的作用，因此自hIAPP发现W来，hIAPP与糖尿病的关系就 一直为人关注。自1999年至2010年，我们收集了香港中文大学医学院、北京协和医院和 解放军总医院病理科436例2型DM的人体解剖组织样本W及相应临床资料，详细观察了 膜腺组织改变，系统研究了膜岛淀粉样变的临床病理学特征，结果显示hIAPP有可能具有 重要内分泌调节作用。（参考文献：（I)ZhaoHL,LaiFM,TongPC,etal.Prevalenceand clinicopathologicalcharacteristicsofisletamyloidinChinesepatientswith type2diabetes.Diabetes.Nov2003 :52(11):2759-2766. (2)ZhaoHL,SuiY,加anJ，et al.Higherisletamyloidloadinmenthaninwomenwithtype2diabetesmellitus. Pancreas.Oct2008:37 (3):e68-73. (3)ZhaoH^GuanJ,SuiY,HeL,LaiFF.Islet amyloidosisandbeta-cellneogenesisinchroniccalcifyingpancreatitiswith non-insuIin-dependentdiabetesmellitus.Pancreas.Apr2009 ;38 (3):342-344. (4)ZhaoHL,SuiY,GuanJ,etal.Amyloidoligomersindiabeticandnondiabetic humanpancreas.Transl民es.Jan2009 ; 153 (I) : 24-32. (5)ZhaoH,GuanJ,LeeHM,et al.Up-regulatedpancreatictissuemicro民NA-375associateswithhumantype 2diabetesthroughbeta-celldeficitandisletamyloiddeposition.Pancreas.Aug 2010 ;39 (6) :843-846.)在体内外研究hIAPP的生物学功能和药理疗效过程中，我们发现 hIAPP不仅可W调节炎症反应和免疫因子分泌，具有重要的免疫调节作用；而且对体内糖 稳态的调节起重要作用。（赵海漉，张均智，牟学晶.一种人类多肤在制备免疫调节剂中 的应用.公开号CN102441159B.)
[0006] 人类的饮食养生，五谷为养，五果为助，五畜为益，五菜为充"为原则。蔬菜瓜果 与油料作物是人类生存长期所依赖的食物，在食物链中属于一级能量的来源，其来源广泛， 营养丰富，具有普遍适应性。葫芦科、豆科、W及茄科植物是世界上最重要的食用植物科属， 其重要性仅次于禾本科的五谷粮食。
[0007]《本草纲目》记载：黄瓜味甘，性平，又称青瓜。具有明显的清热解毒、生津止渴的功 效。苦瓜味甘，性平。除邪热，解劳乏，清屯、明日。苦瓜虽然口感略苦，但余味甘甜，近年来 渐渐风靡餐桌。西瓜、香瓜是夏天非常受欢迎的水果。南瓜则具有补中益气，消炎止痛，解 毒杀虫，降糖止渴的功效；冬瓜、丝瓜还具有清热、解暑、解毒、利尿、消肿的功效，是夏暑的 理想蔬菜。西红柿营养丰富，风味特别，是全世界栽培最为广泛的果蔬之一，生吃熟吃，棒汁 做酱均受欢迎。豆角与秋葵更是备受青睐的营养蔬菜。它们的共同特征是：人类可W直接 生吃或者稍加工即可食用。但运类蔬菜瓜果本身不含hlAPP，不具备hIAPP的作用。
[0008]目前尚未见有利用人类日常生活所依赖的此类蔬菜为天然'工厂（Plant)'生产出 具有调控糖代谢作用的重要蛋白-人类膜淀素，即表达人类膜淀素的蔬菜瓜果培育方法的 文献和专利报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种表达人类膜淀素的蔬菜瓜果的培育方法。
[0010] 实现本发明目的的技术方案是：
[0011] 一种表达人类膜淀素的蔬菜瓜果的培育方法，包括如下步骤：
[001引 （1)提取一种含有人类膜淀素基因编码序列的质粒DNA;所述的基因包含37个氨 基酸，分子中第二和第屯位半脫氨酸残基之间形成二硫键，径基末端酷胺化，中间第20-29 位氨基酸组成具有种属差异性；氨基酸序列为KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSN TY；
[0013] 似构建质粒表达载体，该表达载体包含膜淀素化IAP巧基因的 CAMV35S-hIAPP-N0S表达框，具体是指抗卡那霉素选择标记的植物表达载体--pcambia-C AMV35S-hIAPP-N0S-1301 ；
[0014] (3)采用花粉管通道法导入人类膜淀素基因，培育表达人类膜淀素的蔬菜瓜果；
[0015] (4)检测上述蔬菜瓜果在Fl代苗中hIAPP的表达。
[0016] 步骤（1)所述人类膜淀素质粒DNA的提取，其方法是：
[0017] 在超净工作台上挑取保存的菌体接种在LB固体培养基上培养，菌板置于恒溫培 养箱，37°C培养12h，至单菌落产生；挑取单菌落接种于LB液体培养基，在恒溫摇床上37°C、 285r/min过夜培养（1化左右至对数生长后期），待0D600值为0. 5-0. 8时可用于质粒DNA 的提取；采用裂解法提取质粒DNA，将DNA提取液稀释100倍，用T肥RMO超微量分光光度计 测定其在波长260纳米和280纳米波长下的吸收值，0D260/0D280在1. 8-1. 9之间为高纯 度DNA大于1. 9则有RNA污染，小于1. 8说明有蛋白质污染；DNA浓度按W下公式计算：DNA 浓度（纳克/微升）=0D260X50X稀释倍数；将质粒DNA用PH为7. 5的双蒸水稀释为 100-1000微克/毫升分装好胆藏在-20°C冰箱中备用；
[0018] 步骤（