[0062] 培育表达人类膜淀素的南瓜，其余同实施例1。
[006引实施例7:
[0064] 培育表达人类膜淀素的香瓜，其余同实施例1。
[006引实施例8 :
[0066] 培育表达人类膜淀素的西瓜，其余同实施例1。
[0067] 实施例9:
[0068] 培育表达人类膜淀素的秋葵，其余同实施例1。
[0069] 实施例10 :
[0070] 培育表达人类膜淀素的丝瓜，其余同实施例1。
[007 ^ 实施例11 :
[0072] 表达人类膜淀素的黄瓜对糖尿病前期小鼠与糖尿病小鼠血糖、发病率、死亡率的 影响
[0073] 1建立糖尿病小鼠模型
[0074] 8-12周龄小鼠禁食不禁水12h后，测定血糖值。实验时分成两组，阴性对照组（只 注射生理盐水），模型组（尾静脉一次性注射120mg/kg链尿佐菌素），然后小鼠分组饲养， 自由进食进水，两周后测定血糖值。结果表明，糖尿病小鼠模型构建成功；
[00巧]2供试材料为Fl代成功表达hIAPP基因的黄瓜。将黄瓜分别进行粉碎液处理。应 用于糖尿病前期小鼠与糖尿病小鼠的灌胃试验中；
[0076] 3将上述Fl代成功表达hIAPP黄瓜汁分别对糖尿病前期小鼠与糖尿病小鼠进行灌 胃实验，试验分为阴性对照组，空白对照组，实验组。每天下午4点进行灌胃试验，试验组给 予Fl代已表达人类膜淀素的黄瓜新鲜果汁，剂量为0. 06-60克/千克/天。阴性对照组予 W(与Fl代同等条件培育）未进行转导的黄瓜新鲜果汁，剂量为0. 06-60克/千克/天。 空白对照组进行灌服蒸馈水，剂量为0. 06-60毫升/千克/天。连续灌胃3天，每天一次。 测量不同黄瓜汁剂量对小鼠灌胃后30分钟，2小时的空腹血糖值。试验表明，试验组的新鲜 黄瓜汁最佳剂量为30克/千克/天；相当于人用量3. 34克/千克/天；
[0077] 3. 1灌胃糖尿病小鼠试验中，空白组用剂量为30毫升/千克/天的蒸馈水，2小 时后空腹血糖从17. 38 + 9. 89毫摩尔升高到19. 34+10. 75毫摩尔，平均升高1.96毫摩 尔。阴性对照组剂量为30克/千克/天，2小时后空腹血糖从24. 77 + 5. 46毫摩尔降低到 24. 52 + 5. 00毫摩尔，平均下降0. 25毫摩尔。实验组用30克/千克/天的表达hIAPP的黄 瓜新鲜果汁，2小时后空腹血糖从25. 05 + 8. 91毫摩尔降低到19. 58 + 5. 25毫摩尔，平均下 降5. 47毫摩尔（P= 0. 001，与空白组相比）；试验组2小时后空腹血糖下降是阴性对照组 21倍（P= 0. 004)。结果显示糖尿病小鼠使用适量已表达hIAPP的黄瓜汁后可W显著改善 糖尿病小鼠的血糖水平；
[0078] 3. 2用剂量为30克/千克/天的表达hIAPP的黄瓜汁灌胃糖尿病前期小鼠，2小 时后空腹血糖从9. 21 + 10. 2毫摩尔显著降低到6. 19 + 0. 92毫摩尔（P= 0.0008)，平均下 降3.Ol毫摩尔。结果显示使用本发明的黄瓜对糖尿病前期小鼠有明显的改善血糖，降低发 病风险的作用；
[0079] 3. 3用剂量为30克/千克/天的表达hIAPP的黄瓜汁灌胃糖尿病前期小鼠与糖尿 病小鼠。统计灌胃后7天、20天糖尿病小鼠空腹血糖从大于20毫摩尔降低至6. 0-10毫摩 尔个数所占的百分数分别是23%与55%。表明本发明黄瓜对糖尿病小鼠有促进改善血糖 水平，辅助治疗糖尿病的效果。统计糖尿病前期小鼠灌胃后第15天、第60天、第180天后 糖尿病发生率、糖尿并发症发生率W及死亡率。结果显示灌胃表达hIAPP的黄瓜汁的试验 组与对照组相比，其糖尿病发生率、并发症发生率W及死亡率均明显降低。
[0080] 实施例12:
[0081] 表达人类膜淀素的苦瓜对糖尿病前期小鼠与糖尿病小鼠血糖、发病率、死亡率的 影响。
[0082] 按照实施例11的方法步骤进行，不同的是：
[0083]I)用剂量为40克/千克/天的苦瓜汁灌胃糖尿病小鼠，相当于人剂量4. 45克/ 千克/天。2小时后空腹血糖从26. 4 + 2毫摩尔降低到19. 3 + 3. 1毫摩尔；空腹血糖平均下 降7. 10毫摩尔。阴性对照组2小时后空腹血糖从23. 67 + 8. 43毫摩尔降低到23. 45 + 9. 15 毫摩尔，平均下降0. 22毫摩尔。试验组2小时后空腹血糖比阴性对照组显著降低（P= 0. 036)。
[0084] 2)用剂量为40克/千克/天的表达hIAPP的苦瓜汁灌胃糖尿病前期小鼠，2小 时后空腹血糖从11. 6 + 0. 86毫摩尔显著降低到6. 5 + 2. 2毫摩尔（P= 0. 0003)，平均下降 5 + 2. 13毫摩尔；表明本发明的苦瓜汁灌胃糖尿病前期小鼠可W改善其血糖水平，降低发 病率，促进恢复健康状态。
【主权项】
1. 一种表达人类胰淀素的蔬菜瓜果的培育方法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 构建一种含有人类胰淀素基因编码序列的质粒DNA; (2) 构建质粒表达载体，该表达载体包含胰淀素基因的CAMV35S-hIAPP-N0S表达框， 具体是指抗卡那霉素选择标记的植物表达载体--pcambia-CAMV35S-hIAPP-N0S-1301 ; (3) 采用花粉管通道法导入人类胰淀素基因，培育表达人类胰淀素基因的蔬菜瓜果； (4) 检测试验蔬菜瓜果在F1代苗中hlAPP的表达，获得表达人类胰淀素的蔬菜瓜 果。2. 根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：步骤（1)所述的质粒DNA的氨基酸序 列为KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY。3. 根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：步骤（1)所述的人类胰淀素质粒DNA 的提取方法是： 在超净工作台上挑取保存的菌体接种在LB固体培养基上培养，菌板置于恒温培养箱， 37°C培养12h，至单菌落产生；挑取单菌落接种于LB液体培养基，在恒温摇床上37°C、 285r/min过夜培养> 13h，待0D600值为0. 5-0. 8时可用于质粒DNA的提取；采用裂解 法提取质粒DNA，将DNA提取液稀释100倍，用THERMO超微量分光光度计测定其在波长 260纳米和280纳米波长下的吸收值，0D260/0D280在1.8 -1.9之间为高纯度DNA大于 1.9则有RNA污染，小于1.8说明有蛋白质污染；DNA浓度按以下公式计算：DNA浓度 (纳克/微升）=〇D260X50X稀释倍数；将质粒DNA用PH为7. 5的双蒸水稀释为100-1000 微克/毫升分装好贮藏在-20 °C冰箱中备用。4. 根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：步骤（2)所述的质粒表达载体的构建 步骤如下： (1) 将PCR克隆得到的植物表达启动子CAMV35S用ΚρηΙ和SacI酶切回收后连入 到表达载体pcambia-1301，得到载体pcambia-CAMV35S_1301 ; (2) 将PCR克隆得到的胰淀素基因hlAPP用ΚρηΙ和Xbal酶切回收后连入到载体 pcambia-CAMV35S-1301，得到载体pcambia-CAMV35S-hIAPP-1301 ; (3) 将PCR克隆得到的终止子NOS用Xbal和HINDIII酶切回收后连入到载体 pcambia-CAMV35S-hIAPP-1301，得到质粒表达载体pcambia-CAMV35S-hIAPP-N0S-1301。5. 根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：所述培育表达人类胰淀素的蔬菜瓜 果的方法是采用花粉管通道法，转化人类胰淀素基因；即是在盛花期选择健康的雌花进行 人工授粉，授粉后2-12h，将外源目的质粒DNA溶液2-3微升，用微量注射器从柱头中心推向 子房深处2-3cm，轻轻拔出注射器，在柱头上保留液滴，重新隔离该种子至种子成熟，成熟后 收获得到F1代种子。6. 根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：所述表达人类胰淀素的蔬菜瓜果为 黄瓜、苦瓜、西红柿、冬瓜、南瓜、香瓜、西瓜、丝瓜或秋葵。7. 权利要求1-6之一所述培育方法培育的表达人类胰淀素的蔬菜瓜果作为制备预防 和治疗糖尿病药物的应用，其特征在于：将表达人类胰淀素的蔬菜瓜果让人食用，用于调控 糖代谢。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述食用剂量为3. 34- 4. 45克/千克/ 天。
【专利摘要】一种表达人类胰淀素的蔬菜瓜果的培育方法及应用，是将人类胰淀素基因用KpnI和XbaI酶切回收后连入植物表达载体CAMV-1301？中，构建得到抗卡那霉素基因的植物表达载体？pcambia-CAMV35S-hIAPP-NOS-1301。本发明通过花粉管通道法，将胰淀素基因成功地转化到蔬菜瓜果自交系F1代中，并获得了表达胰淀素基因的转化植株。本发明培育方法能将人类胰淀素基因成功转化到蔬菜瓜果中。通过食用含有人类调控糖代谢的重要蛋白激素-胰淀素的蔬菜瓜果，使人们在饮食中就可以预防和辅助糖尿病的治疗，同时避免了一般药物固有的难题—耐药性以及各种不良反应。还可以减轻糖尿病患者承受注射用药、口服用药的经济负担和心理负担以及各种不良反应。
【IPC分类】A61K38/22, A61K48/00, A01H5/00, A61P3/10, C12N15/82
【公开号】CN105296532
【申请号】CN201510807485
【发明人】赵海潞, 吴伟洁, 于兰, 彭云滔, 邹霞, 张晓溪, 王彦超, 王敏, 林冰洁, 王善欢, 耿利军, 刘道光, 李婉, 赫兰
【申请人】桂林医学院
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月19日