一种检测蝴蝶兰突变体的方法与流程

本发明涉及植物品种监测技术领域，具体地，涉及一种检测蝴蝶兰突变体的方法。

背景技术：

蝴蝶兰是原产于亚洲热带地区的一类兰科植物，花形奇特，花色丰富，具有极高的观赏价值和经济价值。蝴蝶兰的规模化生产目前主要通过组织培养的途径繁殖种苗，这使得其生产成本较高，生长周期较长，从组培出瓶苗到开花售卖大概需要18个月。然后，由于组培过程中的诸多诱变因素，蝴蝶兰在组培过程中会产生一定量的突变体，突变体并不符合商品生产的要求，又会加大生产成本，对大规模商品化生产非常不利。所以高效的蝴蝶兰突变体检测技术非常必要。

目前用于蝴蝶兰突变体的检测方法有RAPD检测，如2013年肖文芳等公开几种常见蝴蝶兰组培突变体的RAPD检测方法，利用7条随机引物能够将‘红彤’蝴蝶兰及其花缺刻型突变体区分开，利用6条引物能够将‘满天红’蝴蝶兰及其花色嵌合型突变体区分开，但是未能从50条随机引物中找到相关引物将‘红彤’蝴蝶兰与其花瓣唇瓣化突变体。虽然RAPD检测方法同样适用于突变体检测，但是，该检测方法具有不可克服的缺陷：（1）实验重复性和稳定性极差；（2）凝胶电泳只能分开长度差异较大的DNA片段，而不能分开那些分子量相同或差异很小的样品。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种检测蝴蝶兰突变体的方法，在瓶苗期就筛选掉不符合生产需求的突变体，节约大规模生产的生产成本。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的。

由SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十对引物组成，SSR1引物序列如SEQ ID：1～2所示，SSR2引物序列如SEQ ID：3～4所示，SSR3引物序列如SEQ ID：5～6所示；SSR4引物序列如SEQ ID：7～8所示；SSR5引物序列如SEQ ID：9～10所示；SSR6引物序列如SEQ ID：11～12所示；SSR7引物序列如SEQ ID：13～14所示；SSR8引物序列如SEQ ID：15～16所示；SSR9引物序列如SEQ ID：17～18所示；SSR10引物序列如SEQ ID：19～20所示；所述蝴蝶兰的品种为满天红、光芒四射、V31和红珍珠。

本发明利用10对引物的组合就能够完全将‘满天红’、‘光芒四射’、V31和‘红珍珠’4个品种及其突变体全部区分开。

本发明还要求保护如上所述的引物组合在SSR荧光标记毛细管电泳检测蝴蝶兰突变体中的应用。

一种检测蝴蝶兰突变体的方法，包括如下步骤：提取待测蝴蝶兰的总DNA，以SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十对引物分别进行PCR，PCR产物分别进行SSR荧光标记毛细管电泳检测，将待测蝴蝶兰的检测结果和正常蝴蝶兰的结果进行对比，如果两者的结果不相同，判定待测蝴蝶兰为突变体。

优选地，所述PCR的反应体系为2.5×Buffer V 6.0 µL，上游和下游引物（5 µM）1.0 µL，Taq酶（5 U·µL^-1）0.1 µL，DNA 1.0 µL，ddH₂O补齐至15 µL。

优选地，所述PCR的反应程序为95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 sec，58 ℃ 35 sec 35个循环，72 ℃ 35 sec，60 ℃ 30 min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十对引物的组合就能够完全将‘满天红’、‘光芒四射’、V31和‘红珍珠’4个品种及其突变体全部区分开，SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十对引物的序列如SEQ：1～20所示。本发明的检测方法可以在瓶苗期就筛选掉不符合生产需求的突变体，节约大规模生产的生产成本。

附图说明

图1为利用引物SSR8的检测图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

‘满天红’、‘光芒四射’、V31和‘红珍珠’4个品种来源于市场购买。

实施例1

（1）总DNA的提取：分别取0.2 g‘满天红’、‘光芒四射’、V31和‘红珍珠’四种蝴蝶兰根尖组织，按照本领域总DNA的常规提取方法或常规试剂盒提取‘满天红’、‘光芒四射’、V31和‘红珍珠’四种蝴蝶兰的总DNA。

（2）PCR反应：以SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十对引物分别进行PCR。

PCR反应体系为2.5×Buffer V 6.0 µL，上游和下游引物（5 µM）1.0 µL，Taq酶（5 U·µL^-1）0.1 µL，DNA 1.0 µL，ddH₂O补齐至15 µL；

反应程序为95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 sec，58 ℃ 35 sec 35个循环，72 ℃ 35 sec，60 ℃ 30 min。

SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十对引物的序列见表1。

表1引物序列信息表

（3）3730XL测序仪检测及分析：96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液(0.5:8.5) 9 μL，PCR产物1.0 μL，95 ℃变性3 min后，上机检测。将检测得到的原始数据文件导入到分析软件中进行分析。

利用本发明提供的分子标记对4个不同品种的蝴蝶兰（‘满天红’、‘光芒四射’、V31和‘红珍珠’）及其突变体（‘满天红’、‘光芒四射’和V31为花色突变体，‘红珍珠’为花期突变体）进行检测，结果如表2所示。

表2 实验用4个蝴蝶兰品种及其突变体的检测数据

由表2结果可知：10个SSR荧光标记对4个蝴蝶兰品种及其突变体的检测中只有SSR4没有多态性，其余引物均能在一定程度上将各个品种或者正常株与突变体之间区分开，利用其中3对引物SSR3+SSR8+SSR9的组合就能够完全将4个品种及其突变体全部区分开。这10个SSR荧光标记引物是利用从市场搜集的400多个蝴蝶兰品种及部分品种在组培过程中产生的突变体的DNA筛选出来普遍使用于蝴蝶兰的SSR荧光标记引物，虽然未对更多类型的突变体进行检测，但是从实例的4个突变体检测效率来看，对蝴蝶兰突变体的检测较为适用，能够区分一些生产上较为常见的蝴蝶兰突变体。

（4）提取待测蝴蝶兰的总DNA，以SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十对引物分别进行PCR，PCR产物分别进行SSR荧光标记毛细管电泳检测，将待测蝴蝶兰的检测结果和正常蝴蝶兰的结果进行对比，如果两者的结果不相同，判定待测蝴蝶兰为突变体。