一种亚油酸含量相关的芝麻基因及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及与一种亚油酸含量相关的芝麻基因sifad2，同时还涉及该基因在酿酒酵母微生物初生代谢物分泌和作物品质育种中的应用，亚油酸含量相关芝麻基因sifad2在酿酒酵母细胞和拟南芥中的过量表达表明，此基因可显著提高酿酒酵母细胞和植物种子的亚油酸含量，应用于改良微生物出油品质和作物品质。

背景技术：

芝麻(sesamumindicuml.)属胡麻科草本植物，世界范围内广泛栽培和利用的优质油料和特色经济作物。芝麻种子含油量高，平均可达55％，有“油料皇后”之美称，含有丰富的蛋白质、甾醇、卵磷脂、维生素e等营养成分，还富含钙、磷、铁等重要元素，芝麻中的芝麻素和芝麻酚林等特色保健成分，经研究证明具有强抗氧化和抗癌等功能。因此，芝麻广受人民喜爱，其需求量和消费量随着人民生活水平的上升而逐年增加。芝麻中脂肪酸含量丰富，主要由亚油酸和油酸组成，其比例分别占芝麻脂肪酸总量的44.32％和42.18％。

亚油酸属ω-6系不饱和脂肪酸，是其他不饱和脂肪酸的前体，是人和动物营养中必需的脂肪酸，具有重要的生理功能。亚油酸参与磷脂的合成并以磷脂的形式作为线粒体和细胞膜的重要成分，促进胆固醇和类脂质的代谢，合成前列腺素的前体，保护皮肤免受由x射线引起的损害，有利于促进动物精子的形成等。除此之外，亚油酸还有助于生长、发育以及妊娠。人体缺乏亚油酸会出现生长过缓甚至停滞以及皮肤损伤等症状，因此说，亚油酸是最为有效、也最为普遍的ω-6脂肪酸。对人体主要功能还包括降血脂，预防动脉硬化、高胆固醇血症和高血脂症的作用以及提高细胞免疫功能的作用。同时，亚油酸在工业上应用也较多，亚油酸的钠盐或钾盐是肥皂的成分之一，并可用作乳化剂等表面活性剂。

油酰磷脂酰胆碱去饱和酶(l-acyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine△12-desaturase，fad2)，存在于内质网上，其可以催化单不饱和脂肪酸脱氢形成第二个双键，双键位于脂肪酸烃链的第12个碳位置上，是形成多不饱和脂肪酸的第一步反应，主要催化油酸转化为亚油酸，对植物油中油酸和亚油酸的含量、比例均具有调控作用，是植物脂肪酸代谢通路中的关键酶。fad2基因是油酰磷脂酰胆碱去饱和酶(fad2酶)的编码基因，故其是调控植物中油酸转化为亚油酸的关键基因。目前，多种植物中的fad2基因被分离得到，包括油菜、花生、大豆、向日葵、玉米等食用油农作物，也包括拟南芥、烟草、菠菜等非食用油作物，以及橄榄、蓖麻等木本植物。khadake等(2009)发现亚麻lufad2-2和lufad2被转化到酿酒酵母中，两基因在酿酒酵母中表达，并具有油酸转化为亚油酸的作用。okuley(1994)等在拟南芥中发现fad2基因，并将其分离克隆出来，通过研究得出：fad2是编码油酸去饱和酶的重要基因，在植物的整个生长发育期均有表达。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题包括提供一种(sesamumindicuml.)亚油酸含量相关的芝麻基因sifad2、编码蛋白及应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

提供一种亚油酸含量相关的芝麻基因sifad2，该基因的核苷酸序列为seqidno.1所示，或为由该序列在添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的具有同等功能的核苷酸序列。通过将亚油酸含量相关芝麻基因sifad2在酿酒酵母和拟南芥中的过量表达，发现此基因可显著提高酿酒酵母细胞和植物种子的亚油酸含量，为微生物亚油酸含量分泌和植物品质改良提供基因资源。

提供一种芝麻sifad2蛋白，其具有如seqidno.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明包括通过各种方法获得的、如seqidno.2所示氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质以及编码这些衍生蛋白质的基因。

本发明还包括含有sifad2核苷酸序列的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞如含有所述核苷酸序列或其片段的转化酿酒酵母细胞。

sifad2基因构建到表达载体pyes2。通过热激转化方法，将pyes2携带的sifad2基因转入酿酒酵母细胞中，获得酿酒酵母转化细胞。实验结果表明，sifad2具有提高酿酒酵母细胞的亚油酸含量的作用。本发明将sifad2基因构建到表达载体pbi121。通过农杆菌介导转化方法，将pbi121携带的sifad2基因转入拟南芥，获得拟南芥转化植株。实验结果表明，sifad2具有提高植物种子亚油酸含量的作用。本发明还提供上述sifad2基因、载体或宿主细胞在调节酿酒酵母细胞亚油酸含量中的应用。

本发明还提供上述sifad2基因、载体或宿主细胞在调节植物种子亚油酸含量中的应用。

本发明所述的一种提高亚油酸含量的芝麻基因sifad2获得方法，包括如下步骤：

(1)从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中根据产量相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果，采取逐级取样策略，选取了705份芝麻材料进行重测序分析；

(2)利用illuminahiseq2500测序平台，用2×76双末端测序法对705份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序，获得了2.6倍覆盖的基因组序列；

(3)结合种质资源群体中的种子亚油酸含量数据、基因型数据和群体结构，采用emmax软件包和peal程序对芝麻相关性状进行全基因组关联分析，在p＝10^-4.65水平检测到1个位于6号连锁群上3279380的位置与芝麻亚油酸含量显著关联的标记位点，解释8.7％的表型变异；(4)通过芝麻参考基因组(http://ocri-genomics.org/sinbase/index.html)比对和基因注释分析，发现距离显著关联标记位点24428bp的位置存在sin_1009785基因，该基因的拟南芥同源基因为fad2，是拟南芥亚油酸合成基因，因此，推测该基因可能与芝麻亚油酸含量相关，命名为sifad2；

(5)根据sifad2基因的cds序列，利用primer5.0设计可以扩增其完整cds序列的引物，引物序列及名称如下：

sifad2-f：5’-cccgggatgggagccggagg-3’

sifad2-r：5’-gagctctcagaacttgttct-3’；

(6)取中芝13发育25天的蒴果，提取种子总rna，逆转录生成cdna，以反转后的cdna为模板，利用步骤(5)中的引物sifad2-f/r进行rt-pcr扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得提高亚油酸含量相关的芝麻sifad2基因序列，如seqidno.1所示；

(7)通过上述方法获得了亚油酸含量相关芝麻基因sifad2，采用一种提高sifad2表达活性的转基因酿酒酵母细胞和拟南芥，其特征在于转基因酿酒酵母细胞和转基因植物表现为sifad2含量增加，比受体对照(非转基因酿酒酵母和植株)的细胞和种子亚油酸含量有所提高。

克隆本发明中所述的亚油酸含量相关的基因sifad2的方法是本领域中所常用的方法。提取植物叶片dna是常用的分子生物学技术，提取mrna的方法也有多种成熟的技术，试剂盒(easyspinplusplantrnakit)可从商业途径获得(购于aidlabbiotechnologiesco.,ltd)。构建本发明中所述的载体和将载体转入植株所用到的酶切、连接、酵母转化、花序侵染等方法也是本领域中常用技术。其中所涉及的质粒(pbi121和pyes2)，转染用媒体(如酿酒酵母菌株invsc1、根癌农杆菌gv3101和所用试剂成分如蔗糖、卡那霉素等)可从商业途径获得。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明是国内外首次公开报道了亚油酸含量相关芝麻基因sifad2序列，存在于内质网上，本发明中的亚油酸含量相关基因sifad2及其编码蛋白，与拟南芥同源基因(at3g12120.2，fad2)同源度分别为73％和74％。通过其过量表达可提高酿酒酵母细胞和植物种子亚油酸含量。本发明实验结果表明转基因酿酒酵母和拟南芥sifad2的含量与受体对照(非转基因酵母细胞和植株)相比均有很大程度的提高，酵母细胞和拟南芥种子亚油酸含量也因此得到提高。因此本发明提出可利用sifad2的过量表达来提高微生物细胞的亚油酸含量，改良微生物菌株的出油品质；以及利用sifad2的过量表达来提高植物种子的亚油酸含量以便用于油料作物高亚油酸品种的选育，由此来提高食用油的品质，改善人们膳食营养。

附图说明

图1为含sifad2基因的酿酒酵母表达载体pyes2-fad2的构建；

图2转sifad2基因酵母菌株的pcr鉴定结果示意图(m：marker；1-7：阴性菌株；8-10：阳性菌株；空：转空载体菌株)；

图3阳性酵母菌株定量表达验证结果图；

图4气相色谱法测定转sifad2基因酵母各脂肪酸组分含量以及总脂肪酸含量；

图5为含sifad2基因的植物表达载体pbi121-fad2的构建；

图6转sifad2基因拟南芥t1代阳性植株的筛选结果示意图；

图7转sifad2基因拟南芥t1代的pcr鉴定结果示意图(m：marker；1-14：转基因t1代植株；阳：阳性对照；阴：阴性对照)；

图8转sifad2基因拟南芥t2代阳性植株的筛选结果示意图；

图9转sifad2基因拟南芥t2代的pcr鉴定结果示意图(m：marker；1-25：转基因t2代植株)；

图10转sifad2基因拟南芥t2代种子定量表达验证结果图；

图11气相色谱法测定转sifad2基因拟南芥种子各脂肪酸组分含量以及总脂肪酸含量。

具体实施方式

通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)，或draper等人(blackwell科学出版社，1988)所述的条件，或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。

实施例1：亚油酸相关芝麻基因sifad2的获得

本发明所述的一种提高亚油酸含量相关芝麻基因sifad2获得方法，包括如下步骤：

(1)从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中根据产量相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果，采取逐级取样策略，选取了705份芝麻材料进行重测序分析；

(2)利用illuminahiseq2500测序平台，用2×76双末端测序法对705份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序，获得了2.6倍覆盖的基因组序列；

(3)结合种质资源群体中的种子亚油酸含量数据、基因型数据和群体结构，采用emmax软件包和peal程序对芝麻相关性状进行全基因组关联分析，在p＝10^-4.65水平检测到1个位于6号连锁群上3279380的位置与芝麻亚油酸含量显著关联的标记位点，解释8.7％的表型变异；

(4)通过芝麻参考基因组(http://ocri-genomics.org/sinbase/index.html)比对和基因注释分析，发现距离显著关联标记位点24428bp的位置存在sin_1009785基因，该基因的拟南芥同源基因为fad2，是拟南芥亚油酸合成基因，因此，推测该基因可能与芝麻亚油酸含量相关，命名为sifad2；

(5)根据sifad2基因的cds序列，利用primer5.0设计可以扩增其完整cds序列的引物，引物序列及名称如下：

sifad2-f：5’-cccgggatgggagccggagg-3’

sifad2-r：5’-gagctctcagaacttgttct-3’；

(6)取中芝13发育25天的蒴果，提取种子总rna，逆转录生成cdna，以反转后的cdna为模板，利用步骤(5)中的引物sifad2-f/r进行rt-pcr扩增，将扩增得到的片段进行测序，获得亚油酸含量的芝麻基因sifad2，其序列为seqidno.1所示。

实施例2：一种提高亚油酸含量的芝麻基因sifad2在提高酿酒酵母细胞亚油酸含量中的应用

1)将实施例1克隆得到的亚油酸含量相关的基因sifad2利用同源重组的方法与pyes2(vazyme公司)质粒连接构建植物表达载体，命名为pyes2-fad2(图1)；

2)将步骤1)中制备的载体pyes2-fad2转入酿酒酵母invsc1中(invitrogen公司)；

3)转基因酵母阳性检测

挑取步骤2)中获得的酵母单克隆5-10个到sd-u基础培养基中，30℃振荡过夜培养，提取酵母质粒，利用sifad2-1f/1r引物，对挑取的转基因酵母单克隆和转空载体酵母进行pcr检测(图2)，获得转基因阳性酵母(图2中的1-7号菌株)。

酵母质粒提取方法参照北京天根生物技术公司酵母质粒小提试剂盒。

sifad2-1f：5’-gccgttcgttctccta-3’

sifad2-1r：5’-gtgcgtatctgtgatgttat-3’

4)阳性酵母菌株定量表达验证

取阳性酵母菌株以及转pyes2空载体酿酒酵母菌株为对照的同一批繁殖培养的菌株，通过诱导培养基诱导培养，利用easyspin酵母rna快速提取试剂盒(艾德莱生物)提取各菌液rna，并反转录cdna，以各自cdna为模板，以pyes2载体上的ura3基因为内参(pf：5’-gctggccgcatcttctcaaa-3’；pr：5’-tatcggctttattgctcaaa-3’)，进行qrt-pcr表达验证。结果表明以转pyes2空载体酿酒酵母菌株为对照，芝麻sifad2基因在3个酵母转基因菌株中具有较大的差异表达，而在转pyes2空载体酵母对照菌株中，没有检测到芝麻sifad2基因的表达(图3)。表明芝麻的sifad2基因均转化并插入到了相应酵母基因组中并得到了表达。

5)转基因酵母亚油酸含量分析

分别挑取转pyes2-fad2基因单克隆和转pyes2空载体酿酒酵母菌株进行诱导培养基诱导培养，当od＝2.0时低温离心收集菌体，收集的菌体于-80℃冷冻30min，并于冷冻干燥机中干燥，然后利用气相色谱法分别测定转基因酵母和转pyes2空载体酿酒酵母菌株中的亚油酸含量。结果表明测试的转sifad2基因的酵母菌株，较转pyes2空载酵母菌株亚油酸(c18:2)含量都有显著的升高(图4)。通过芝麻sifad2基因的过量表达，酵母菌株中亚油酸含量明显升高。

实施例3：一种提高亚油酸含量的芝麻基因sifad2在植物品质改良育种中的应用

1)将实施例1克隆得到的亚油酸含量相关的芝麻基因sifad2利用同源重组的方法与pbi121(vazyme公司)质粒连接构建植物表达载体，命名为pbi121-sad(图5)；

2)将步骤1)中制备的载体pbi121-fad2转入根癌农杆菌gv3101(invitrogen公司)，再导入拟南芥植株中；

3)筛选t1代阳性植株：

种植拟南芥t0代所收获的种子，将t0代种子消毒，接种含卡那霉素的ms筛选培养基上筛选阳性植株(图6，右图是左图局部放大图)。筛选出的阳性植株的叶片dna提取后，利用实施例1步骤(5)中的pcr鉴定引物sifad2-f/r，进行转基因植株的pcr分子鉴定(图7)，最终确认基因已经转入的t1代阳性植株。

4)转基因植株t2代阳性检测

将t1代阳性植株进行单株收种获得t1代种子，继续进行卡那霉素筛选获得t2代阳性植株(图8)，获得的阳性植株移栽生长，提取叶片基因组dna利用实施例1步骤(5)中的目的基因引物sifad2-f/r进行pcr分子鉴定(图9)，确定t2代阳性植株。

5)t2代阳性植株定量表达验证

取t2代阳性植株以及未转基因拟南芥野生型对照的同一生长时期的幼嫩角果，各自cdna为模板，以拟南芥β-actin为内参(af：5’-cccgctatgtatgtcgcca-3’；ar：5’-aaccctcgtagattggcacag-3’)，进行qrt-pcr表达验证。结果表明以未转基因的野生型拟南芥为对照，芝麻sifad2基因在3个拟南芥转基因株系的角果中具有较大的差异表达，而在未转基因对照拟南芥的角果中，没有检测到芝麻sifad2基因的表达(图10)。表明芝麻的sifad2基因均转化并插入到了相应拟南芥基因组中并得到了表达。

6)t2代阳性拟南芥种子亚油酸含量的测定

待t2代转基因种子成熟后，收集种子，利用气相色谱法分别测定拟南芥转基因种子和未转基因野生型拟南芥种子中亚油酸含量。结果表明与野生型拟南芥对照相比，本研究获得的转sifad2基因拟南芥株系亚油酸(c18:2)含量明显升高(图11)，表明芝麻sifad2基因的过量表达可以促进油酸向亚油酸转化，从而提高植物种子的亚油酸含量。

sequencelisting

<110>中国农业科学院油料作物研究所

<120>一种亚油酸含量相关的芝麻基因及其应用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1152

<212>dna

<213>芝麻(sesamumindicuml.)

<400>1

atgggagccggaggacgcatgtctgatccaacaacgaaagacgaacaaaagaagaacccc60

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ccaccacactgcttcgagagatccgtcagccgttcgttctcctatgtcgtttacgatctc180

gtcattgttttccttctctactacattgcgacttcttacttccatctgctgccatcccca240

tactgctacctagcttggcccatttactgggctgtacaaggctgcgtttgcaccggaatc300

tgggtcattgcccatgaatgtggccaccatgcattcagcgattaccagtggcttgacgac360

acagttggcctcatcctgcactctgccctgctcgtgccctatttctcatggaaatacagc420

caccgccgccaccactccaacactggatcccttgagcgtgacgaagtcttcgtcccaaag480

ccaaaatccagagtctcgtggtactccaaatacttgaacaatccacttggcagagtcatc540

acacttgtggttactcttactctcggttggcctctatacttgctgtttaatgtctctggc600

aggccttacaaccgttttgcatgccactttgacccatatggtccaatatataatgaccgt660

gagagacttcaaatcttcatctccgatgctggtataattgctgctgtatgtgtgctttat720

cgtgttgctttggtcaaagggttggcttggctggtatgtgtttatggggtaccgttactc780

attgtcaacggtttccttgttttgatcacattccttcagcacactcacccttcgttgccg840

cactatgattcttccgagtgggactggctaaggggagctcttgcaactgtcgacagagat900

tatggggtgctaaataaggtgttccataacatcacagatacgcacgtgactcaccacctt960

ttctcaacgatgccacattaccatgcaatggaggcaactaaggcaatcaagcccatactg1020

ggccagtattatcagtttgatggaaccccgttttacaaggcgatgtggagggaggcaaag1080

gaatgtctgtatgtcgagccagacgagagtactccagacaagggtgtattctggtacaag1140

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<212>prt

<213>芝麻(sesamumindicuml.)

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51015

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202530

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354045

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505560

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110115120

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140145150

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155160165

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170175180

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230235240

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260265270

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275280285

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380