一种转基因青蒿植株及其培育方法
【技术领域】
[0001]本发明属于代谢工程领域，设及一种转基因青葛植株及其培育方法，具体设及一 种高产青葛素和具有草甘麟抗性的青葛植株及其培育方法。
【背景技术】 阳00引青葛（ArtemisiaannuaL.)是菊科葛属的一年生草本植物。青葛素 (artemisinin)是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半祗内醋化合物，是目前 世界上公认的最有效的治疗追疾的药物，特别是对于脑型追疾和抗氯哇追疾具有速效和低 毒的特点。2011年9月，中国科学家屠哟哟因为发现青葛素获得拉斯克奖和葛兰素史克中 国研发中屯、"生命科学杰出成就奖"。2015年10月，屠哟哟获得诺贝尔生理学或医学奖，她 成为首获科学类诺贝尔奖的中国人。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗追疾的方法 就是青葛素联合疗法（Artemisinin-basedcombinationtherapies，ACTs)。另外，随着对 青葛素药理研究的逐步深入，科学家发现青葛素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤 W及免疫调节的功能。可见青葛素是一种极具潜力的天然药物。
[0003] 目前青葛素的主要来源是从青葛植株的地上部分提取，然而青葛中青葛素的含量 非常低化01%-1%)，使得运种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青葛素结构复 杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方 法来生产青葛素，然而青葛素在愈伤组织中的含量低于干重的0. 1%，在芽中最高也只有干 重的0. 16%，而大多数研究在根中没有检测到青葛素。因此利用组织培养及细胞工程来生 产青葛素的可行性也不高。
[0004] 除草剂的使用作为现代农业的重要标志之一，对大型现代化农场的建立和发展起 到了重要的推动作用。但是，长期W来，青葛田化学除草问题比较难解决。选育抗除草剂作 物品种是一种高效、低成本的控制杂草的手段。草甘麟是一种有机憐类除草剂，其除草原理 是通过抑制定位于植物叶绿体内膜的5-締醇式丙酬酸莽草酸-3-憐酸合成酶巧PSPS)的 活性，阻碍植物体内芳香族氨基酸的生物合成，最终导致植物死亡。抗草甘麟转基因作物为 人们提供了一种能够有效控制杂草的新途径。
[0005] 因此，本领域技术人员仍然致力于开发一种高产青葛素和具有草甘麟抗性的青葛 植株及其培育方法。
【发明内容】
[0006] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种高产青葛素 和具有草甘麟抗性的青葛植株及其培育方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供了一种转基因青葛植株，该转基因青葛植株增强了 法尼基焦憐酸合成途径和莽草酸途经。
[0008] 进一步地，该转基因青葛植株导入了外源目的基因hmgr、巧S、化r2和巧sps。其 中，基因hmg;r(3-^基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶，3-hy^ox}f-3-methylgluta巧1 CoA reductase)、fps(法尼基焦憐酸合成酶，farnesyldiphosphatesynthase)和dbr2 (青葛 醒双键还原酶基因，doublebondre化Ctase2gene)是从青葛中克隆获得的，是法尼基焦 憐酸合成途径中的关键酶，其序列可W从NCBI上获得，hmgr:GeneBank:AF142473. 1，巧S: GeneBank:U36376.I，dbr2 :GeneBank:抓704257. 1。epsps是人工合成的具有草甘麟抗性的 基因，其序列已经在中国发明专利化03826892. 2(发明名称：高抗草巧麟的EPSP合成酶及 其编码序列）中公开。本领域技术人员可知，上述通过克隆获得的基因，还可W通过基因合 成的方法获得。
[0009] 本发明还提供一种培育转基因青葛植株的方法，在本发明的一个较佳实施例中， 该方法包括：
[0010] 1)构建含有hmgr、巧S、化r2和巧sps基因的植物表达载体，将上述基因可操作地 连入植物表达在；
[0011] 2)将步骤1)中获得的植物表达载体转化根癌农杆菌，形成含有hmgr、巧S、化r2 和epsps基因的根癌农杆菌； 阳012] 3)利用步骤2)中获得的含有hmgr、巧S、化r2和巧sps基因的根癌农杆菌转化青 葛，检测获得的转基因青葛植株；
[0013] 4)测定转基因青葛植株中的青葛素含量；
[0014] 5)利用草甘麟筛选具有草甘麟抗性的转基因青葛植株。
[0015] 从而获得高产青葛素并具有较强的草甘麟抗性的转基因青葛植株。
[0016] 进一步地，步骤1)中的植物表达载体为PCAMBIA1305. 1植物表达载体。
[0017] 进一步地，步骤2)中的根癌农杆菌为根癌农杆菌EHA105菌株。
[0018] 进一步地，步骤3)中检测获得的转基因青葛植株方法为分子检测方法，具体为 PCR法，根据CaMV35S的序列设计正向引物，根据hmgr、巧S、化r2和巧sps基因分别设计 反向引物，从而分别对hmgr、巧S、化r2和巧sps基因进行DNA扩增，查看上述基因的整合情 况，观察到有目的条带的阳性植株即为转基因青葛植株。
[0019] 进一步地，步骤4)中测定转基因青葛植株中的青葛素含量的方法为高效液相色 谱法-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD)测定。
[0020] 进一步地，高效液相色谱法在如下条件下进行：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相 为甲醇：水，其中，甲醇：水的体积比为70 % : 30 %，柱溫30°C，流速1. 0血/min,进样量 10yL;蒸发光散射检测器测定在如下条件下进行：蒸发光散射检测器漂移管溫度40°C，放 大系数为7,载气压力化ar。
[0021] 进一步地，步骤5)中选择商业用草甘麟异丙胺盐水剂，配置浓度为2-3g/L草甘麟 水溶液，对转基因植株和非转基因植株进行喷洒。 W22] 本发明还提供一种载体，该载体为含有hmgr、巧S、化r2和巧sps基因的PCAMBIA1305. 1植物表达载体。
[0023] 本发明还提供一种根癌农杆菌，该根癌农杆菌转化有含有hmgr、巧S、化r2和 epsps基因的植物表达载体。
[0024] 本发明还提供上述转基因青葛植株在规模化生产青葛素及提供高产、稳定新药源 中的应用。
[00巧]3-径基-3-甲基戊二酷辅酶A还原酶（HMGR)、法尼基焦憐酸合成酶（FP巧和青葛 醒双键还原酶基因值BR2)是法尼基焦憐酸合成途径中的关键酶，而法尼基焦憐酸是青葛 素合成的前体。采用基因工程手段，用关键酶基因hmgr、巧S和化r2转化青葛，将增加法尼 基焦憐酸的合成速度，为青葛素的生物合成提供更多的前体，从而获得青葛素高产的青葛 植株。
[00%]抗除草剂基因epsps导入青葛后可改善其莽草酸途经，在有草甘麟存在的情况下 继续合成芳香族氨基酸，从而维持青葛的正常代谢，提高青葛的草甘麟抗性，从而为规模化 生产青葛素提供一条新途径。
[0027] 本发明采用共转化含hmgr、巧S、化r2和巧SPS基因的代谢工程策略，建立了稳 定提高青葛中青葛素含量W及青葛草甘麟抗性的方法，获得了青葛素高产的转基因青葛植 株，为规模化生产青葛素提供了一种理想方法和材料。
[0028]W下将结合附图对本发明的构思、具体方法及产生的技术效果作进一步说明，W 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0029]图 1 是本发明的一个较佳实施例的pCAMBIA1305. 1: :p35s-epsps-hmg;r-fps-dbr2 载体构建图谱。
[0030] 图2是本发明的一个较佳实施例的转基因青葛植株的hmgr、巧S、化r2和巧sps基 因PCR阳性检测与阴性对照结果图。其中，M:分子量标记；1 :阳性对照；2 :阴性对照；3-12 : 10个实验组。
[0031] 图3是本发明的一个较佳实施例的经过草甘麟喷洒后，转基因与非转基因青葛成 活情况。其中，左一为非转基因青葛植株对照；右一和右二为转基因青葛植株。
【具体实施方式】
[0032] 本发明中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行，例如Sambrook等 的《分子克隆：实验室手册》（NewYork=ColdSpringHarborL油oratoryPress, 1989)中 所述的条件进行，或按照制造厂商所建议的条件进行。
[0033] 本发明使用的试剂，如未注明，均可从市场上直接购买获得。
[0034] 本发明中的PCR方法