honometh}d)glycine3mg/L+Cb500mg/L)上，并于 25°C、1 化/化光照 培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得EPSPS抗性丛生芽。将生长良好的 抗性丛生芽剪下转入生根培养基（1/2MS+Cb125mg/L)上培养至生根，从而获得草甘麟抗 性再生青葛植株。其中，6-BA为6-苄基嚷岭，NAA为糞乙酸，N- (Phosphonometh5d)glycine 为N-(憐酷甲基）甘氨酸，Cb为簇节青霉素。
[0097] 3.转基因青葛植株的PCR检测
[0098] 根据CaMV35S的序列设计正向引物，根据hmgr、巧S、化r2和巧sps基因的序列分 别设计反向引物，对目的基因进行PCR检测。
[0099] 其中用于PCR检测的引物序列为：
阳10引 PCR条件为：95°C预变性5min;94°C变性30s;55°C退火30s;72°C延伸2min，35个 循环；72°C延伸IOmin。
[0109]PCR结果如图2所示，用CaMV35S正向引物和hmgr反向引物、CaMV35S正向引物 和巧S反向引物、CaMV35S正向引物和化r2反向引物W及CaMV35S正向引物和巧sps反 向引物能分别扩增出1704bp、103化p、1143bp和1565bp的特异DNA片段。而W非转化青葛 基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。因此，成功获得了含hmgr、巧S、化r2和巧SPS 基因的转基因青葛植株。
[0110] 实施例3 阳111]利用HPLC-ELSD测定转基因青葛中青葛素含量[0112] 1.HPLC-ELSD条件及系统适用性W及标准溶液的配制：
[0113]HPLC(高效液相色谱）：采用WaterAlliance2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶 柱（SymmetiraiieldTMC18,5]im，250X4. 6mm，Waters)，流动相为甲醇：水，甲醇：水的体 积比为70:30,柱溫30°C，流速1. 0血/min,进样量10yL，灵敏度（AUFS= 1. 0)，理论塔板数 按青葛素峰计算不低于2000。
[0114]ELSD(蒸发光散射检测器）：采用WaterAlliance2420系统，蒸发光散射检测器 漂移管溫度40°C，放大系数（gain)为7,载气压力化ar。
[0115] 精密称取青葛素标准品（Sigma公司）2.Omg用ImL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青 葛素标准品溶液，保存于-20°C备用。 阳116] 本发明中流动相为甲醇（methanol):水，比例为70% :30%时，青葛素的保留时间 为5.Imin,峰型良好。理论塔板数按青葛素计算不低于2000。 阳117] 2.标准曲线的制作 阳11引将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2y1、4y1、6y1、8y1和10y1， 记录图谱及色谱参数，分别W峰面积（Y)对标准品含量狂，yg)进行回归分析。通过研究， 本发明中青葛素在4-20yg范围内呈现良好的log-log线性关系。青葛素对照品的log-log 线性回归方程为：Y= 1. 28e+000X+4. 71e+000,R= 0. 979546。
[0119] 3.样品的制备和青葛素含量的测定
[0120] 青葛素的提取过程基于VanNieuwerbur曲等人（2006)中报道的方法：取少量新 鲜的青葛叶片（l-2g鲜重），于50ml试管中将其浸没在IOml氯仿中摇荡1分钟，将浸出液 倒入新的试管中使氯仿挥发完全，取3ml无水乙醇充分溶解提取物，用于HPLC检测。同时， 氯仿提取后的叶片收集放入60度烘箱进行烘干，称重，用于计算青葛叶片的干重。 阳121] 采用HPLC-ELSD测定青葛素含量，样品进样体积为20y1，根据峰面积代入上述线 形回归方程计算出样品中的青葛素含量（mg)，再除W样品的青葛叶干重（g)，从而计算出 转基因青葛植株中青葛素的含量。 阳122] 在本发明中共转含hmgr、巧S、化r2和epsps基因显著提高了青葛中青葛素含量。 共转含hmgr、巧S、化r2和巧sps基因的转基因青葛中青葛素的含量最高可达到26. 2mg/g DW(即干重的2. 62% )，是非转化普通青葛曲ng/gDW，即干重的1% )的2. 8倍。 阳123]实施例4
[0124] 喷洒草甘麟检测转基因青葛的草甘麟抗性
[01巧]选择商业用草甘麟异丙胺盐水剂，配置浓度为2g/L(2%。）和3g/L(3%。）草甘麟 水溶液，对共转含hmgr、巧S、化r2和epsps基因的转基因青葛植株和非转基因的青葛植株 进行喷洒，观察青葛的生长状况，从而判断青葛对草甘麟耐受性。如图3所示，在所有浓度 下，非转基因青葛植株全部死亡，而共转含hmgr、巧S、化r2和巧sps基因的转基因青葛植株 (图3右一和右二）可W正常存活。
[01%] W上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创 造性劳动就可W根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员 依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可W得到的技术 方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种转基因青蒿植株，其特征在于，所述转基因青蒿植株增强了法尼基焦磷酸合成 途径和莽草酸途经。2. 如权利要求1所述的转基因青蒿植株，其特征在于，所述转基因青蒿植株导入了外 源目的基因hmgr、fps、dbr2 和epsps。3. -种培育转基因青蒿植株的方法，其特征在于，包括： 1) 构建含有hmgr、fps、dbr2和epsps基因的植物表达载体； 2) 将步骤1)中获得的所述植物表达载体转化根癌农杆菌，形成含有hmgr、fps、dbr2 和epsps基因的根癌农杆菌； 3) 利用步骤2)中获得的所述含有hmgr、fps、dbr2和epsps基因的根癌农杆菌转化青 蒿，检测获得的转基因青蒿植株； 4) 测定所述转基因青蒿植株中的青蒿素含量； 5) 利用草甘膦筛选具有草甘膦抗性的转基因青蒿植株。4. 如权利要求3所述的培育转基因青蒿植株的方法，其特征在于，步骤1)中所述植物 表达载体为PCAMBIA1305. 1植物表达载体。5. 如权利要求3所述的培育转基因青蒿植株的方法，其特征在于，步骤2)中所述根癌 农杆菌为根癌农杆菌EHA105菌株。6. 如权利要求3所述的培育转基因青蒿植株的方法，其特征在于，步骤4)中测定所述 转基因青蒿植株中的青蒿素含量的方法为高效液相色谱法-蒸发光散射检测器测定。7. 如权利要求6所述的培育转基因青蒿植株的方法，其特征在于，所述高效液相色谱 法在如下条件下进行：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇：水，其中，甲醇：水的体积 比为70% : 30%，柱温30°C，流速1.OmL/min，进样量10μL;所述蒸发光散射检测器测定在 如下条件下进行：蒸发光散射检测器漂移管温度40°C，放大系数为7,载气压力5bar。8. -种载体，其特征在于，所述载体为含有hmgr、fps、dbr2和epsps基因的 PCAMBIA1305. 1植物表达载体。9.一种根癌农杆菌，其特征在于，所述根癌农杆菌转化有含有hmgr、fps、dbr2和epsps 基因的植物表达载体。10. -种如权利要求1所述的转基因青蒿植株在规模化生产青蒿素及提供高产、稳定 新药源中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种导入了外源目的基因hmgr、fps、dbr2和epsps的转基因青蒿植株及其培育方法，包括：1)构建含有hmgr、fps、dbr2和epsps基因的植物表达载体；2)将获得的植物表达载体转化根癌农杆菌；3)利用获得的含有hmgr、fps、dbr2和epsps基因的根癌农杆菌转化青蒿，检测获得的转基因青蒿植株；4)测定转基因青蒿植株中的青蒿素含量；5)利用草甘膦筛选具有草甘膦抗性的转基因青蒿植株。本发明采用共转化含hmgr、fps、dbr2和epsps基因的代谢工程策略，建立了稳定提高青蒿中青蒿素含量以及青蒿草甘膦抗性的方法，获得了青蒿素高产的转基因青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法和材料。
【IPC分类】C12N15/84, A01H5/00, C12N1/21, G01N30/02
【公开号】CN105296536
【申请号】CN201510770670
【发明人】唐克轩, 刘萌, 石璞, 付雪晴, 沈乾, 孙小芬, 王国丰
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年11月12日