一种用青蒿生产菌丝霉素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术和基因工程技术领域，具体设及一种用青葛生产菌丝霉素的 方法。
【背景技术】
[0002] 中国是畜牧养殖大国，每年生产的动物饲料在存放过程中因腐败变质引起的损失 巨大。因此大量生产商在饲料中添加化学防腐剂，但残留在动物机体内的化学防腐剂不仅 影响了畜禽产品的质量，还威胁到人们的身体健康，如引发肠胃炎等疾病，影响肝、肾功能 等。另一方面，为了预防畜牧的疾病，动物饲料中长期大量地添加抗生素，由此引发的动物 消化道素乱、耐药性问题也日益严重。
[0003] 抗菌肤（Antibacterialpeptide,AB巧是动物先天性免疫的重要组成部分，抗菌 谱广，对细菌、真菌、分枝杆菌、螺旋体、披膜病毒、支原体、衣原体、螺旋体W及一些恶性细 胞（如肿瘤细胞）和艾滋病病毒都具有杀伤作用。由于抗菌肤主要是通过与细胞膜上的氨 基酸相互作用，W此穿透细胞膜、扼杀细菌，所W细菌难W对其产生抗性。此外，抗菌肤是一 种小分子多肤，是天然存在的一类物质，因而不存在残留的问题。因此发展具有自主知识产 权的新型抗菌肤产品，替代化学防腐剂和抗生素，对于我国畜牧业的安全、健康、和谐发展 具有重要意义。
[0004]防御素是动植物体内一类富含半脫氨酸的抗菌肤，对多种微生物均具有较强的防 御能力，是目前颇具吸引力的一类新型候选抗菌药物。菌丝霉素是丹麦生物技术公司于 2005年从腐生子囊菌的分泌蛋白中分离出的首例真菌防御素。菌丝霉素的成熟功能片段只 有40个氨基酸，其分子量约为4. 4KDa，对革兰氏阳性菌有较强的杀菌作用，例如肺炎链球 菌、脈性链球菌、金黄色葡萄球菌等。此外，菌丝霉素无细胞毒性、无溶血性、脑脊液渗透性 好，且能对抗肺炎球菌和肺炎链球菌，杀灭对传统抗生素有抵抗力的一些菌种，不产生耐药 性，与传统使用的抗生素之间不存在交叉抗性，因此作为新一代抗生素替代品具有巨大的 发展潜力。
[0005] 由本公司之前发明的一种菌丝霉素在酿酒酵母中高效表达的方法，酵母生长速率 快，菌丝霉素表达量高，易于高密度培养，适用于固体或液体发酵；发酵过程中，无需添加甲 醇诱导，避免了因甲醇残留带来的危害；表达分泌的菌丝霉素易于分离纯化，产物纯度高。 但是一旦由实验室扩展到工业化规模生产时，由于培养基中维持质粒高拷贝数的选择压力 消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，因此外源菌丝霉素基因的表达量也随之下降。同时，相 对于植物表达载体而言，酵母的生产成本、技术要求也更加严格。
[0006] 而青葛（Artemisiacarvi化lia)为一年生草本，具有清热、凉血、退蒸、解暑、桂 风、止痒之效。花蕾期采收，割取地上部分，切碎，晒干后，可直接用作饲料添加。青葛作为 生产菌丝霉素的植物，还具有粗生易管，生长期短，投资少，收益快等优点。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种用青葛生产菌丝霉素的方法。
[0008] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0009] 所述用青葛生产菌丝霉素的方法，其特征在于，所述方法包括W下步骤：
[0010] (1)改造载体T202 ;改造后的载体T202序列如SEQIDNO. 1所示；
[0011] (2)构建青葛中表达改造后的菌丝霉素基因的重组质粒T202-Plec，重组质粒 T202-Plec的序列如沈QIDNO. 2所示；
[0012] (3)用重组质粒T202-Plec转化青葛；
[0013] (4)筛选阳性转基因青葛植株，获得生产菌丝霉素的青葛植株。
[0014] 优选地，步骤（1)所述改造载体T202的过程如下：
[0015] (a)WpCambial300为模板，用如下引物对TDNA的pRB序列进行PCR扩增（产物 长度为44化P)，pRB序列如SEQIDNO.6所示：
[0016]引物pRB-Fl:5, -GAATTCACTGGGAATTCCCTGGCGTTA-3'(沈QIDNO. 7);EcoRI
[0017] 引物pRB-Rl:5, -GGTACCCAGCCTGTCGGGTACCTTAGGA-3' (沈QIDNO.8);ΚρηΙ
[0018] (b)将PCR扩增得到的pRB序列测序鉴定；将正确的pRB序列连接到pCambial301 上，得到载体PC13001T，载体PC13001T序列如沈QIDNO. 3所示；
[0019] (C)用ΚρηΙ和Smal酶切Actin启动子，同时用ΚρηΙ和PmacI酶切载体PC13001T， 将酶切的载体PC13001T与酶切的Actin启动子进行连接，构建成改造后的载体T202。
[0020] 优选地，步骤似所述构建青葛中表达改造后的菌丝霉素基因的重组质粒 T202-Plec的过程如下：
[0021] (a)合成改造后的菌丝霉素基因序列，并将其保存于PMD19Simple质粒中，改造后 的菌丝霉素基因序列如SEQIDNO. 4所示；
[0022] (b)用如下引物对保存于PMD19Simple质粒中的改造后的菌丝霉素基因进行扩 增：
[0023]引物PlecF1 :5, -CTGCAGCAAGATGGGTTTTGGTTGT-3'(沈QIDNO. 9);PstI
[0024]引物PlecR1 :5, -TCTAGACTTGTCGTCGTCTTAGTAACAC-3'(沈QIDNO. 10);XbalI [00巧](c)将PCR扩增得到的改造后的菌丝霉素基因测序鉴定；将正确的改造后的菌丝 霉素基因与T-载体连接，得到载体Plec-T，载体Plec-T序列如SEQIDNO. 5所示；
[0026] (d)用PstI、甜aI分别酶切改造后的载体T202和载体Plec-T，将酶切的改造后 的载体T202和酶切的载体Plec-T连接，构建成重组质粒T202-Plec。
[0027] 下面对本发明作进一步说明：
[002引步骤（1)所述改造载体T202的过程中，PCR反应条件：94°C5min预变性， 94°C30s-59°C30s-72°C70s，30个循环，72°C7min;经2%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目 的片段，保存于-20°C备用；将得到的pRB片段与T-载体连接，得到pRB-T载体，转化大肠 杆菌D册α菌株，37°C下，用化ndIII和甜alI双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定；将克隆 到的pRB序列连接到pCambial301上，酶切位点为巧coRI-Kpnl，GAATTCGGTACC)，新载 体命名：pC13001T。用化nl和Smal酶切Actin启动子（事先由本课题组成员克隆连接入 pMDlSTVector,并测序显不正确），同时用ΚρηΙ和PmacI酶切pC13001T，与Actin启动子 进行连接，构建成改造后的载体T202。选择EcoRI单酶切，应出现81化P的条带。
[002引步骤似中改造克隆菌丝霉素基因的过程如下：
[0030] 改造菌丝霉素基因的过程如下：
[0031] (a)利用SeqnConverter软件分析青葛基因组蛋白编码序列。
[0032] 从NCBI(ht1:p://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中筛选蛋白表达量较高、基因功能 注释明确的基因，运用软件SeqnConve;rte;r(ht1:p://www.cibj.com/seqnconverter.zip) 分析筛选出的101条完整的蛋白编码序列，计算青葛同义密码子相对使用度（relative synonymouscodonusage,RSCU):某一密码子所使用的频率与其在无偏性使用时预期频率 之比。如果某一密码子的同义密码子相对使用度（relativesynonymouscodonusage) RSCU= 1，表明该密码子的使用没有偏好性；如果RSCU> 1，表明该密码子的使用偏爱性相 对较高。
[0033] 化）菌丝霉素基因密码子优化
[0034] 在保持菌丝霉素蛋白氨基酸序列不变的前提下，把其中RSCU值小于0. 5的密码 子替换成青葛偏爱的密码子，即在同义密码子组中RSCU值最大的密码子；RSCU值在0. 5~ 1. 0之间的密码子只是部分替换成青葛偏爱的密码子；而RSCU值在1W上的密码子不作改 变。同义密码子替换过程中，降低密码子ACC、AGC、GCC及CCC所占的比例，W减少可能发生 甲基化的位点。
[0035] (C)化ly(A)加尾识别位点分析
[0036] 青葛偏爱密码子优化后的菌丝霉素基因序列可能含有化ly(A)加尾识别序列。采 用同义密码子替换法消除化ly(A)加尾识别序列（AATAAA<SEQIDNO. 17〉，ATTAAA<SEQID NO. 18〉，AACCAA<SEQIDNO. 19〉和AATTAA<SEQIDNO. 20〉），W保证菌丝霉素基因转录的完 整性。
[0037] (d)内含子切割识别序列分析
[0038] 上述优化后的菌丝霉素基因序列可能存在内含子剪切信号序列。用SoftBerry在 线服务器化ttp:/linuxl.sof忧erry.com/berry.地tml)预测出潜在的内含子切割识别序 列，再W同义密码子替换法消除内含子切割识别序列，W保证菌丝霉素基因转录的完整性。
[0039] 对改造后的菌丝霉素基因进行扩增时，PCR反应条件：94°C5min预变性， 94°C30s-56°C30s-72°C20s，30个循环，72°C7min;经2%琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化目 的片段，保存于-20°C备用；将得到的菌丝霉素基因与T-载体连接，得到载体Plec-T，转化 大肠杆菌D册α菌株，37°C下，用PstI和甜alI双酶切筛选阳性菌株，测序鉴定。
[0040] 步骤似中步骤（d)的具体过程为：用PstI、甜aI分别酶切改造后的载体T202 和载体Plec-T，产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳后，回收菌丝霉素基因片段和载体T202片段； T4连接酶，16°C连接化得到重组质粒T202-Plec，转化大肠杆菌D册α菌株；转化后提取质 粒DNA进行酶切鉴定。将检测正确的质粒，转化入农杆菌中，-70°C保存备用。
[0041] 步骤（3)是用农杆菌介导的转化法侵染青葛并得到转基因青葛苗；筛选阳性植 株，并进行PCR鉴定，所述筛选阳性菌株的方法是利用实时定量RT-PCR扩增检测其表达量。 野生的青葛里面没有菌丝霉素，所W只要转基因青葛里面有菌丝霉素，就是阳性。PCR鉴定 阳性率、RT-PCR