专利名称：一种利用植物细胞生产青蒿素的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，特别涉及用黄花蒿、长春 花、烟草、何首乌毛状根作为培养体系，以青蒿酸，二氢青蒿酸等青蒿素生物合 成途径的中间体生物制造青蒿素类化合物的方法。
背景技术：
青蒿素(Artemisinin, Arteannuin, Qinghaosu)来汰菅于菊禾斗植物黄花蒿(^他w/w.a a"mwL.)，是一个含有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，系我国科学家1972年首 先从中药黄花蒿中分离得到的有效单体，它不仅对多种对氯喹、甲氟喹、抗乙胺 嘧啶等抗疟药具有抗药性的疟原虫有显著的治疗效果，而且还具有很好的治疗肝 炎、抑制肿瘤细胞生长、杀血吸虫等作用。但由于该化合物在原植物中的含量很 低(在黄花蒿中的含量约为0.01% 1%)，其供应远远不能满足市场需求。
目前市场上供应的青蒿素多为直接从植物中提取获得，栽培的黄花蒿为青蒿 素的主要植物材料来源。但田间栽培技术容易受到季节变化、病虫、真菌、细菌 等感染的影响；同时也存在着成本高、周期长、产量难以保证等问题。此外，单 纯依靠天然资源还存在着提取分离费时、费力、浪费资源等诸多问题。
另外，虽然化学全合成青蒿素己在实验室获得成功，但其过程非常复杂，且 存在副产物多、产率很低等缺点，因此，工业化应用价值不大。
植物细胞培养具有产生特定次生代谢产物的巨大潜力。在植物细胞培养中， 一些重要的次生代谢产物并不形成和累积。但是，这样的培养物却保留了将外源 底物转化为有用产物的能力。植物悬浮细胞培养、固定化细胞培养、转基因毛状 根培养、转基因冠瘿组织培养以及酶都可以特异性的将含量丰富、价格低廉的底 物转化成稀有和珍贵的有用物质。
植物悬浮培养细胞转化体系具有直接使用前体、细胞转移限制少、不存在影 响细胞活力和生理状态的介质等优点，因此它是目前使用最多、取得结果最为满意的生物转化系统之一。
利用植物细胞进行生物合成与生物转化既可产生新的化合物，又可生物改造 或修饰已有的化合物，或增加目标产物的产量以及克服化学合成的缺点等。而且， 催化反应可以在比较温和的环境下进行，具有副产物少、耗能少、安全以及减少 开支等优势。
因此，利用植物细胞生产青蒿素具有生长周期短、成本低、产率高、实验可 控、反应条件温和、环境友好等优势，具有很好的工业应用前景。
发明内容
本发明的目的是利用植物细胞作为催化体系，以二氢青蒿酸、青蒿酸、4,11 一紫穗槐二烯等青蒿素生物合成途径的中间体生物制造青蒿素类化合物。通过本 发明的生产方法制造青蒿素类化合物，可以不受季节的影响，且具有快速、高效 的特点，具有很大的工业应用前景。
本发明公丌的是一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其特征在于包括以 下几个歩骤(1)将青蒿素生物合成途径中的中间体类化合物溶解，加入到植物 细胞中，共培养，抽滤，得到培养物和培养基；(2)培养物用有机溶剂提取， 提取物浓縮，得浸膏I; (3)培养基用有机溶剂萃取，萃取液浓缩，得浸膏II; (4)合并以上两种浸膏，分离得到青蒿素类成分。
本发明是通过如下技术方案实现的将二氢青蒿酸等中间体溶解，加入到植 物细胞中，共培养一段时间，抽滤，得到培养物和培养基。培养物用蒸馏水冲洗 干净，于6(TC以下烘干至恒重，粉碎，有机溶剂超声提取,提取物浓縮，得浸膏I。 培养基浓縮至适量，用有机溶剂萃取，萃取液浓縮，得浸膏II，合并两种浸膏， 用层析色谱分离，TLC薄层对照，合并含有青蒿素的组分，用石油醚结晶即得青 蒿素纯品。用该方法生产青蒿素与化学合成相比具有操作简单、步骤少、反应条 件友好等优点；与从植物中提取相比具有周期短、含量高、不受季节和气候影响 等优点。该法之所以具有上述优点是因为植物细胞具有生长速度快(三周即可传 代)、高度选择性(化学选择性、区域选择性和对映体选择性)、实验室可控(不 受季节和气候影响)、酶量充足(反应类型广泛)、反应条件温和、转化率高等特点。
具体实施例方式
下面结合实例，对本发明作进一步的描述。
实施例l取二氢青蒿酸，用无水乙醇溶解，在无菌超净工作台中加入到培 养了十四天的黄花蒿细胞悬浮液中，共培养两天，终止反应，抽滤，分得培养物 和培养基。培养物用蒸馏水冲洗干净，于55匸烘干至恒重，粉碎，用八倍丙酮超 声提取三次，每次半小时，提取物减压蒸干，得浸膏I。培养基浓縮至适量，用等 量乙酸乙酯萃取，萃取液减压蒸干，得浸膏II。合并两种浸膏，用硅胶柱层析分 离，TLC薄层对照，合并含有青蒿素的组分，用石油醚结晶即得青蒿素纯品。用 无水乙醇对植物细胞的毒性低，用无水乙醇溶解二氢青蒿酸类中间体具有溶解度 好，毒性低的作用。超声提取具有提取效率高、操作简便等优点。用硅胶柱层析 分离、石油醚结晶具有成本低、操作简单等特点。
实施例2取青蒿酸，用甲醇溶解，在无菌超净台中加入到对数生长期的长 春花细胞悬浮培养液中，共培养两天，终止反应，抽滤，分别得到培养物和培养 基。培养物用蒸馏水冲洗干净，于55'C烘干至恒重，粉碎，置索氏提取器中，用 十倍乙酸乙酯提取三次,每次半小时，提取物减压蒸干，得浸膏I。培养基浓縮至 适量，用等量乙酸乙酯萃取，萃取液减压蒸干，得浸膏II。合并两浸膏，用硅胶 柱层析分离，TLC薄层对照，合并含有青蒿素的组分，用乙酸乙酯结晶即得纯青 蒿素。
实施例3取4, ll一紫穗槐二烯，用无水乙醇溶解，在无菌超净台中加入到 对数生长期的烟草悬浮细胞培养液中，共培养两天，终止反应，抽滤，分别得到 培养物和培养基。培养物用蒸馏水冲洗干净，于55t:烘干至恒重，粉碎，用乙醇 加热回流提取三次,每次半小时，提取物减压蒸干，得浸膏I。培养基浓缩至适量， 用等量乙酸乙酯萃取，萃取液减压蒸干，得浸膏II。合并两浸膏，用硅胶柱层析 分离，TLC薄层对照，合并含有青蒿素的组分，用甲醇结晶即得青蒿素纯品。
实施例4取二氢青蒿酸，用无水乙醇溶解，在无菌的超净台中加入到何首 乌毛状根培养液中，共培养两天，终止反应，抽滤，分别得到培养物和培养基。 培养物用蒸馏水冲洗干净，于55-C烘干至恒重，粉碎，用八倍体积甲醇浸泡提取 三次，每次半小时，提取物减压蒸干，得浸膏I。培养基浓縮至适量，用等量氯仿 萃取，萃取液减压蒸干，得浸膏II。合并两种浸膏，用硅胶柱层析分离，TLC薄层对照，合并含有青蒿素的组分，用乙醇结晶即得青蒿素纯品。 实施例5取二氢青蒿素B，用丙酮溶解，在无菌环境中加入到黄花蒿细胞悬浮液 中，共培养两天，终止反应，抽滤，分别得到培养物和培养基。培养物于5(TC 烘干至恒重，粉碎，用二氧化碳超临界提取，提取物蒸干，得浸膏I。培养基浓 縮至适量，用等量氯仿萃取，萃取液蒸干，得浸膏II。合并两种浸膏，用硅胶 柱层析分离，TLC薄层对照，合并含有青蒿素的组分，用石油醚结晶即得青蒿素 纯品。
实施例6，用二氢青蒿酸，用DMS0溶解，在无菌环境中加入到对数生长期的长 春花细胞悬浮培养液中，共培养两天，终止反应，抽滤，分别得到培养物和培养 基。培养物用蒸馏水冲洗干净，于55'C烘干至恒重，粉碎，用十倍乙酸乙酯超 声提取三次,每次半小时，提取物蒸干，得浸膏I。培养基浓縮至适量，用等量 乙酸乙酯萃取，萃取液蒸干，得浸膏II。合并两浸膏，用硅胶柱层析分离，TLC 薄层对照，合并含有青蒿素的组分，用石油醚结晶即得纯青蒿素。
权利要求
1. 一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其特征在于包括以下几个步骤(1)将青蒿素生物合成途径中的中间体类化合物溶解，加入到植物细胞中，共培养，抽滤，得到培养物和培养基；(2)培养物以有机溶剂提取，提取物浓缩得浸膏I；(3)培养基用有机溶剂萃取，萃取液浓缩得浸膏II；(4)合并上述两种浸膏，分离得到青蒿素类成分。
2. 根据权利要求1的一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其特征在于，所述 的青蒿素生物合成途径中的中间体类化合物为二氢青蒿酸或青蒿酸或青蒿素B或二氢青蒿素B或4, 11 —紫穗槐二烯。
3. 根据权利要求1的一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其特征在于，第(l) 步骤中所述的植物细胞为黄花蒿、长春花、烟草、何首乌毛状根。
4. 根据权利要求1的一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其特征在于，第(2) 步骤中所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，第(3)步骤中所述的 有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿、石油醚、乙醚、正丁醇。
5. 根据权利要求2的一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其特征在于，第(1) 歩骤中所述的植物细胞为黄花蒿、长春花、烟草、何首乌毛状根。
6. 根据权利要求1的一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其特征在于，第(1) 步骤中溶解青蒿素生物合成途径中的中间体类化合物的溶剂为乙醇、甲醇、丙酮、 乙酸乙酯、二甲基亚砜(DMS0)。
7. 根据权利要求1的一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其特征在于，第(2) 步骤的提取方法为超声提取、二氧化碳超临界提取、溶剂浸泡提取、溶剂回流提 取、索氏提取器提取。
8. 根据权利要求1的一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其特征在于，第(4) 步骤的分离方法为硅胶柱层析法和结晶法。
9. 根据权利要求8的一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其特征在于，结晶 法所用的溶剂为石油醚、乙酸乙酸、甲醇、乙醇。
全文摘要
本发明公开了一种利用植物细胞生产青蒿素的方法，其步骤包括将青蒿素生物合成途径中的中间体类化合物溶解，加入到植物细胞中，共培养，抽滤，得到培养物和培养基；培养物用有机溶剂超声提取，提取物蒸干，得浸膏I；培养基用有机溶剂萃取，萃取液蒸干，得浸膏II；合并两浸膏，分离出青蒿素类成分。利用本法生产青蒿素具有快速、高效的特点，具有很大的工业应用前景。
文档编号C12P17/18GK101503719SQ20091003804
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者于荣敏, 朱建华 申请人:于荣敏