离子交换树脂法从青蒿素生产废料中分离精制二氢青蒿酸的制作方法
【专利摘要】一种离子交换树脂法从青蒿素生产废料中分离精制二氢青蒿酸，该方法是以干燥的青蒿素生产废料为原料，先用氢氧化钠溶液溶解，离心去沉淀，取上清液，慢慢加入经过预处理与平衡处理的阴离子交换树脂，用去离子水冲洗后，进行解吸附，收集洗脱液，真空浓缩，然后用有机溶剂萃取，最后通过结晶，而获得高纯的二氢青蒿酸产品。本发明首次以青蒿素生产废料为原料，采用离子交换树脂法分离纯化二氢青蒿酸；通过联合真空浓缩与有机溶剂萃取技术，降低浓缩时间与能耗，又不需离心或过滤，增加了产品得率并降低了生产成本，产品纯度高，达99%以上；回收率高，达80%以上；操作方便，生产量大，容易实现产业规模化生产。
【专利说明】离子交换树脂法从青蒿素生产废料中分离精制二氢青蒿酸
【技术领域】
[0001]本发明涉及二氢青蒿酸的制法，具体涉及一种采用离子交换树脂法从青蒿酸生产废料中分离精制二氢青蒿酸的方法。
【背景技术】
[0002]黄花蒿是我国国宝级的重要经济作物，其主要活性成分青蒿素是我国开发的第一个被国际公认并有的自主知识产权的天然药物，也是我国唯一被WHO认可的按西药研究标准开发的中药。我国科学家屠呦呦因在发现青蒿素作出的突出贡献于2011年获得了我国首个拉克斯奖。自世界卫生组织将青蒿素认定为目前最安全、有效的抗疟药物，并作为治疗疟疾首先用药后，青蒿素的市场需求急剧增长。目前以青蒿素为原料的药物在31个国家销售，市场非常庞大。据WHO推测，仅非洲每年就超过2.5亿人次需要这类药物，青蒿素需求量为700吨以上，每年的市场达20亿美元。而市场上的青蒿素90%以上来自我国南方及西南地区的黄花蒿作物，可见黄花蒿产业在我国农业经济中占有重要地位。此外，现代药理研究证明，青蒿素、青蒿酸和二氢青蒿素对多种人类和动物肿瘤细胞均具有强效抑制作用，而对正常细胞损伤很小，正被开发成高效、低毒、价廉、谱广的抗癌新药，目前已经入了二期临床试验，黄花蒿的种植需求将进一步膨胀。
[0003]然而，由于我国青蒿素生产工艺落后、生产安全隐患较大、生产成本高以及资源利用率低导致产品价格过高，消费者无力购买，产品滞销，国宝级的黄花蒿产业无法得到应有发展。因此，虽然青蒿素需求量达700吨以上，但近几年我国每年青蒿素销售量仅150吨左右，约8成的市场尚未开拓，造成了我国青蒿素产品积压而发展中国家尤其是非洲南部国家陷入青蒿素类药物严重短缺的尴尬局面。由此可见，黄花蒿产业尚有非常广阔的发展空间，但需降低加工成本、提高资源利用率。
[0004]降低青蒿素生产成本以满足发展中国家对青蒿素产品的需求，已受到国内外广泛关注。由于青蒿素分子结构复杂，手性C原子多，未来10-20年时间内，尚未能采用化学合成的方法获得青蒿素。美国加州大学伯克利分校Keasling教授及其团队在利用基因工程菌生产青蒿酸的研究取得了突破，该团队首次将黄花蒿中amorpha-4, 11-diene synthase(ADS)和cytochrome P450 monooxygenase (CYP71AV1)基因转入酵母菌中表达，在工程酵母菌的发酵产物中获得了青蒿素前体物质青蒿酸，该成果在《Nature》杂志上发表，在后续研究中该团队对发酵条件进行了不断地优化，以提高青蒿酸的含量。虽然目前采用基因工程尚未能获得青蒿素，但获得青蒿酸后，通过化学方法可获得二氢青蒿酸。而二氢青蒿酸被认为可以自发转化为青蒿素，该过程不需要酶的参与。德国的Seeberger教授等人最近的研究表明，采用流动化学的方法可在一台特殊的仪器设备中完成二氢青蒿酸向青蒿素的转变。
[0005]研究表明，利用黄花蒿生产青蒿素较利用工程菌与半合成法生产青蒿素有以下明显优势:首先，工程菌的生长需要外界大量的C源，而黄花蒿可利用无穷无尽的太阳能，其生长基本不需要农药化肥，故生长成本远低于工程菌；其次，目前工程菌无法实现二氢青蒿酸与青蒿素的生产；此外，黄花蒿中本身含有较青蒿素更多量的青蒿酸和二氢青蒿酸，尤其是二氢青蒿酸的含量较高。有研究表明，有些品种中二氢青蒿酸的含量为青蒿素的6倍左右。这些优势说明，黄花蒿资源尚有巨大潜力可挖。在青蒿素的生产过程中，二氢青蒿酸也被同时从植物体中提取出来，但在青蒿素的进一步分离纯化过程中，二氢青蒿酸被留在生产废料中，并没有再加以利用，造成了资源的大量浪费。
[0006]因此，充分利用青蒿素生产废料，已显得非常重要，有望有效解决青蒿素生产废液的污染问题，变废为宝，为体外转化青蒿素提供物质基础，对降低青蒿素生产成本、提高黄花蒿资源利用率、促进我国重要中药资源和中药可持续性发展、提高农民收入有重要意义。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种离子交换树脂法从青蒿素生产废料中分离精制二氢青蒿酸，该法是取干燥的青蒿素生产废料，先用碱性溶液溶解，离心去沉淀，慢慢加入经过预处理与平衡处理的离子交换树脂，用去离子水冲洗后，进行解吸附，收集流出液，真空浓缩，然后用有机溶剂萃取，最后通过结晶获得高纯的二氢青蒿酸产品。
[0008]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:一种离子交换树脂法从青蒿素生产废料中分离精制二氢青蒿酸，该方法步骤如下，请结合参见图1:
(O样品处理:按每升未处理的阴离子交换树脂使用1.0-1.45公斤干燥的青蒿素生产废料的比例，取干燥的青蒿素生产废料(生产废料中含水率〈3%、有机溶剂〈1%。均是指体积质量比)，再按Ig干燥的青蒿素生产废料加3-4.5ml质量体积浓度为0.3%的氢氧化钠溶液的比例，于干燥的青蒿素生产废料中加入氢氧化钠溶液，将青蒿素生产废料搅碎，调节pH值至8.0-9.0, 50-60°C下浸泡20_30min，室温下离心，收集上清液；其中，离心转速为2500-3000rpm/min，时间为 15min ；
(2)上柱、冲洗、解吸:取上述上清液，打开层析柱下端活塞，以1-1.5BV/h的速度通过装有717、D201、201 X 4或D209阴离子交换树脂的层析柱进行上柱，上柱完毕后，关闭层析柱下端活塞，静态吸附至饱和；打开层析柱下端活塞，采用5-6BV的去离子水冲洗，冲洗速度为4-6BV/h ;再取6-10%质量体积浓度的氯化铵溶液和60-85%体积浓度的食用酒精按1:1的体积比混合的混合液，加入层析柱，以2-3BV/h的速度进行洗脱，收集洗脱液；
(3)浓缩、萃取:35-40°C下，真空浓缩上述洗脱液，浓缩至1/3体积，然后于浓缩液中按I:1的体积比，加入有机溶剂萃取两次，合并萃取液，真空浓缩至有机溶剂全部挥干，得二氢青蒿酸粗产品；上述有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷，乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷均为分析纯。
[0009](4)结晶:按Ig 二氢青蒿酸粗产品加3_5ml有机溶剂的比例，于上述二氢青蒿酸粗产品中加入有机溶剂，回流加热至60-70°C，搅拌至完全溶解，过滤，室温放置，直至晶体完全析出，重结晶一次，获得二氢青蒿酸产品；上述有机溶剂为乙酸乙酯、丁酮或石油醚，乙酸乙酯、丁酮和石油醚均为分析纯。
[0010]本发明方法中，于样品上柱前，需对717、D201、201X4或D209阴离子交换树脂进行常规预处理和平衡处理:取阴离子交换树脂，用3倍体积的去离子水浸泡16-20h，去掉去离子水，用1.5倍体积的lmol/L盐酸溶液浸泡8-12h，去掉HCl溶液，用去离子水洗至pH值为7.0,再用1.5倍体积的4%氢氧化钠溶液(W/V)溶液浸泡8h，去掉NaOH溶液，用去离子水洗至PH值为7.0。树脂处理完毕，用2倍体积去离子水悬浮树脂，采用湿法装柱，待树脂完全沉降后，打开层析柱下端活塞，去掉多余的水，待水层达到树脂表层时，加入等体积的0.3%氢氧化钠溶液(W/V)，待氢氧化钠溶液全部渗入树脂后，关闭层析柱下端活塞平，等待样品上柱。
[0011]本发明的有益效果是:本发明首次以青蒿素生产废料为原料，采用离子交换树脂法分离纯化二氢青蒿酸；本方法通过联合真空浓缩与有机溶剂萃取技术，降低浓缩时间与能耗，又不需离心或过滤，增加了产品得率并降低了生产成本，产品纯度高，纯度达99%以上；回收率高，达80%以上；操作方便，生产量大，容易实现产业规模化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是本发明的制备流程图。
[0013]图2是本发明制得的二氢青蒿酸产品含量分析气相色谱图。
【具体实施方式】
[0014]下面本发明将以实施例进行进一步地说明，但是本发明并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
[0015]离子交换树脂按前述过程进行处理。
[0016]实施例1
取完全干燥的青蒿素生产废料100g，加入450mL 0.3%(ff/V)的氢氧化钠溶液，将青蒿素生产废料搅碎，调节pH值至8.0, 50°C浸泡30min,室温下2500rpm离心15min,取上清液。打开层析柱下端活塞，以1.5BV/h的速度上柱(717阴离子交换树脂的最初处理量为10mL),上柱完毕后，关闭层析柱下端活塞，静态吸附至饱和。吸附完毕，打开层析柱下端活塞，采用500mL去离子水冲洗，冲洗速度为6BV/h。取10%(W/V)氯化铵溶液和60%(V/V)食用酒精按1:1体积比混合的混合液，加入层析柱，以3BV/h的速度进行洗脱，收集洗脱液共350mL。40°C下，真空浓缩洗脱液，浓缩至1/3体积，然后用与浓缩液相同体积的乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，真空浓缩至有机溶剂全部挥干，得1.97g 二氢青蒿酸粗产品。取上述二氢青蒿酸粗产品，加入9.85ml分析纯丁酮，回流加热至70°C，搅拌至完全溶解，过滤，室温放置至晶体完全析出，重结晶一次，获得二氢青蒿酸产品1.55g。
[0017]产品检测采用气相检测法，具体方法如下:称取1mg产品，溶解于50mL乙腈中，
0.2 μ m的有机过滤膜过滤，进气相色谱仪检测。色谱条件:FID检测器，HP-5.0弹性石英毛细管柱(30 mX0.32 mmX0.25 μ m)，高纯氮气(99.999%)为载气，流速3mL/min，高纯氮气40 mL/min尾吹，进样口温度235 °C，检测器温度285 °C，分流比1: 1，进样量I μ L，外标法定量。柱升温程序:初始温度180°C，以6°C /min升至220°C后，保持3min，以30°C /min升至 280°C，保持 1min。
[0018]检测结果如图2所示，二氢青蒿酸含量为99.13%。
[0019]实施例2
取完全干燥的青蒿素生产废料725g，加入2200mL 0.3%(ff/V)的氢氧化钠溶液，将青蒿素生产废料搅碎，调节pH值至9.0,60°C浸泡20min,室温下3000rpm离心15min,取上清液。打开层析柱下端活塞，以lBV/h的速度上柱(717阴离子交换树脂的最初处理量为500mL)，上柱完毕后，关闭层析柱下端活塞，静态吸附于饱和。吸附完毕，打开层析柱下端活塞，采用3000mL的去离子水冲洗，冲洗速度为4BV/h。取6%(W/V)氯化铵溶液和85%(V/V)食用酒精按1:1体积比混合的混合液，加入层析柱，以2BV/h的速度进行洗脱，收集洗脱液共1500mL。35°C下，真空浓缩洗脱液，浓缩至1/3体积，然后用500mL 二氯甲烷萃取两次，合并萃取液，真空浓缩至有机溶剂全部挥干，得二氢青蒿酸粗产品13.94g，于该粗产品中加入41.82ml分析纯乙酸乙酯，回流加热至60°C，搅拌至完全溶解，过滤，室温放置，直至晶体完全析出，重结晶一次，获得二氢青蒿酸产品12.18g，经气相色谱检测(方法与实施例1相同)，二氢青蒿酸含量为99.21%。
[0020]实施例3
取完全干燥的青蒿素生产废料1.2kg，加入4.8L 0.3%(ff/V)的氢氧化钠溶液，将青蒿素生产废料搅碎，调节pH值至8.5，55°C浸泡26min，室温下2800rpm离心15min，取上清液。打开层析柱下端活塞，以1.2BV/h的速度上柱(717阴离子交换树脂的最初处理量为100mL),上柱完毕后，关闭层析柱下端活塞，静态吸附至饱和。吸附完毕，打开层析柱下端活塞，采用5.5L去离子水冲洗，冲洗速度为5BV/h。取8%(W/V)氯化铵溶液和70%(V/V)食用酒精按1:1体积比混合的混合液，加入层析柱，以2.5BV/h的速度进行洗脱，收集洗脱液共3.3L。38°C下，真空浓缩洗脱液，浓缩至1/3体积，然后用1.1L氯仿萃取两次，合并萃取液，真空浓缩至有机溶剂全部挥干，得二氢青蒿酸粗产品22.85g，于该二氢青蒿酸粗产品中加入91.40mL分析纯石油醚，回流加热至65°C，搅拌至完全溶解，过滤，室温放置，直至晶体完全析出，重结晶一次，获得二氢青蒿酸产品20.89g，经气相色谱检测(方法与实施例1相同)，二氢青蒿酸含量为99.17%。
[0021]实施例4
取完全干燥的青蒿素生产废料1.2kg，加入4.8L 0.3%(ff/V)的氢氧化钠溶液，将青蒿素生产废料搅碎，调节pH值至8.5，55°C浸泡26min，室温下2800rpm离心15min，取上清液。打开层析柱下端活塞，以1.2BV/h的速度上柱(D201阴离子交换树脂的最初处理量为IlOOmL),上柱完毕后，关闭层析柱下端活塞，静态吸附至饱和。吸附完毕，打开层析柱下端活塞，采用5.5L去离子水冲洗，冲洗速度为4.5BV/h。取9%(W/V)氯化铵溶液和80%(V/V)食用酒精按1:1体积比混合的混合液，加入层析柱，以2.5BV/h的速度进行洗脱，收集洗脱液共3.3L。38°C下，真空浓缩洗脱液，浓缩至1/3体积，然后用1.1L氯仿萃取两次，合并萃取液，真空浓缩至有机溶剂全部挥干，得二氢青蒿酸粗产品21.93g，于该二氢青蒿酸粗产品中加入90.0OmL分析纯乙酸乙酯，回流加热至60°C,搅拌至完全溶解,过滤,室温放置,直至晶体完全析出，重结晶一次，获得二氢青蒿酸产品19.79g，经气相色谱检测(方法与实施例1相同)，二氢青蒿酸含量为99.03%。
[0022]实施例5
取完全干燥的青蒿素生产废料1.2kg，加入4.8L 0.3%(ff/V)的氢氧化钠溶液，将青蒿素生产废料搅碎，调节pH值至8.5，55°C浸泡26min，室温下2800rpm离心15min，取上清液。打开层析柱下端活塞，以1.2BV/h的速度上柱(201X4阴离子交换树脂的最初处理量为1200mL)，上柱完毕后，关闭层析柱下端活塞，静态吸附至饱和。吸附完毕，打开层析柱下端活塞，采用5.5L去离子水冲洗，冲洗速度为5BV/h。取10%(W/V)氯化铵溶液和80%(V/V)食用酒精按1:1体积比混合的混合液，加入层析柱，以2.5BV/h的速度进行洗脱，收集洗脱液共3.0L。40°C下，真空浓缩洗脱液，浓缩至1/3体积，然后用1.0L氯仿萃取两次，合并萃取液，真空浓缩至有机溶剂全部挥干，得二氢青蒿酸粗产品23.99g，于该二氢青蒿酸粗产品中加入90.0OmL分析纯丁酮，回流加热至60°C，搅拌至完全溶解，过滤，室温放置，直至晶体完全析出，重结晶一次，获得二氢青蒿酸产品20.33g，经气相色谱检测(方法与实施例1相同)，二氢青蒿酸含量为99.11%。
[0023] 实施例6
取完全干燥的青蒿素生产废料1.2kg，加入4.8L 0.3%(ff/V)的氢氧化钠溶液，将青蒿素生产废料搅碎，调节pH值至8.5，55°C浸泡26min，室温下2800rpm离心15min，取上清液。打开层析柱下端活塞，以1.2BV/h的速度上柱(D209阴离子交换树脂的最初处理量为1200mL)，上柱完毕后，关闭层析柱下端活塞，静态吸附至饱和。吸附完毕，打开层析柱下端活塞，采用6.0L去离子水冲洗，冲洗速度为5BV/h。取9.5%(ff/V)氯化铵溶液和80%(V/V)食用酒精按1:1体积比混合的混合液，加入层析柱，以2.5BV/h的速度进行洗脱，收集洗脱液共3.6L。38°C下，真空浓缩洗脱液，浓缩至1/3体积，然后用1.2L氯仿萃取两次，合并萃取液，真空浓缩至有机溶剂全部挥干，得二氢青蒿酸粗产品21.33g，于该二氢青蒿酸粗产品中加入91.0OmL分析纯石油醚，回流加热至65°C，搅拌至完全溶解，过滤，室温放置，直至晶体完全析出，重结晶一次，获得二氢青蒿酸产品20.05g，经气相色谱检测(方法与实施例1相同)，二氢青蒿酸含量为99.11%。
【权利要求】
1.一种离子交换树脂法从青蒿素生产废料中分离精制二氢青蒿酸，其特征在于，该方法步骤如下: (1)样品处理:按每升阴离子交换树脂使用1.0-1.45公斤干燥的青蒿素生产废料的比例，取干燥的青蒿素生产废料，再按Ig干燥的青蒿素生产废料加3-4.5ml质量体积浓度为0.3%的氢氧化钠溶液的比例，于干燥的青蒿素生产废料中加入氢氧化钠溶液，将青蒿素生产废料搅碎，调节pH值至8.0-9.0，50-60°C下浸泡20_30min，室温下离心，收集上清液； (2)上柱、冲洗、解吸:取上述上清液，以1-1.5BV/h的速度通过装有阴离子交换树脂的层析柱，静态吸附至饱和；采用5-6BV的去离子水冲洗，冲洗速度为4-6BV/h ;再取6-10%质量体积浓度的氯化铵溶液和60-85%体积浓度的食用酒精按1:1的体积比混合的混合液，以2-3BV/h的速度进行洗脱，收集洗脱液； (3)浓缩、萃取:35-40°C下，真空浓缩上述洗脱液，浓缩至1/3体积，然后于浓缩液中按I:1的体积比，加入有机溶剂萃取两次，合并萃取液，真空浓缩至有机溶剂全部挥干，得二氢青蒿酸粗产品； (4)结晶:按Ig二氢青蒿酸粗产品加3-5ml有机溶剂的比例，于上述二氢青蒿酸粗产品中加入有机溶剂，回流加热至60-70°C，溶解，过滤，室温放置，直至晶体完全析出，重结晶一次，获得二氢青蒿酸产品。
2.如权利要求1的离子交换树脂法从青蒿素生产废料中分离精制二氢青蒿酸，其特征在于，所述步骤(2 )中的阴离子交换树脂是指717、D201、201 X 4或D209阴离子交换树脂。
3.如权利要求1的离子交换树脂法从青蒿素生产废料中分离精制二氢青蒿酸，其特征在于，所述步骤(I)中干燥后的青蒿素生产废料的含水率〈3%、有机溶剂〈1%。
4.如权利要求1的离子交换树脂法从青蒿素生产废料中分离精制二氢青蒿酸，其特征在于，所述步骤(I)中的离心转速为2500-3000rpm/min，时间为15min。
5.如权利要求1的离子交换树脂法从青蒿素生产废料中分离精制二氢青蒿酸，其特征在于，所述步骤(3)中萃取时用的有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷，该乙酸乙酯、氯仿和二氯甲烷均为分析纯。
6.如权利要求1的离子交换树脂法从青蒿素生产废料中分离精制二氢青蒿酸，其特征在于，所述步骤(4)中加入的有机溶剂为乙酸乙酯、丁酮或石油醚，该乙酸乙酯、丁酮和石油醚均为分析纯。
【文档编号】C07C51/47GK104230699SQ201410535332
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月13日 优先权日:2014年10月13日
【发明者】刘硕谦, 田冬铭, 廖欢, 曹娟, 扬威, 吴敦超, 周兰 申请人:湖南农业大学