中，其引物根据引物设计原则设计即可，并不局限于本发明 中列出的实际的序列。PCR的条件可W有适当的更改，W能实现PCR目的即可。 阳0对 实施例1
[0036] 含hmgr、巧S、化r2和巧sps基因的植物表达载体的构建
[0037]需要构建的质粒载体PCAMBIA1305. 1: :p35s-epsps-hmgr-fps-dbr2 的图谱如图 1 所示。 阳03引 1.利用PCR从青葛基因组中克隆获得hmgr、巧S和化r2基因，W及从人工合成的 epsps基因片段继续扩增该基因。
[0039] PCR引物分别为：
[0048] PCR条件分别为：
[0049]hmgr:95°C预变性 5min;94°C变性30s;55°C退火30s;68°C延伸 2min，35 个循环； 68°C延伸IOmin; 阳化0] fps:95°C预变性 5min;94°C变性 30s;55°C退火 30s;68°C延伸 2min，35 个循环； 68°C延伸IOmin;
[0051]dbr2 :95°C预变性 5min;94°C变性30s;55°C退火30s;68°C延伸 2min，35 个循环； 68°C延伸IOmin;
[0052]巧sps:95°C预变性 5min;94°C变性30s;55°C退火30s;68°C延伸 2min，35 个循环； 68°C延伸IOmin。
[0053] 2.中间载体pBI121: :p35S-hmg;r-nos/pBI121: :p35S-fps_nos和 pBI121: :p35S-dbr2-nos载体的构建。
[0054] 用实施例I中hmgr、巧S和化r2基因，分别设计带上下游酶切位点的引物，W便构 建表达载体，并连接到PMD18-T上，形成PMD18-T: :hmgr、pMD18-T::fps和PMD18-T: :dbr2。 用甜al/SacI双酶切pMDlS-T: :hmgr和地1121，回收hmgr和地1121大片段，随后进行连 接。用5*曰1/831611双酶切91018-1'::巧3和地1121，回收巧3和地1121大片段，随后进行 连接。用511131/53(31双酶切91018-1'::化^和地1121，回收化^和地1121大片段，随后进 行连接。形成地1121: :p35S-hmg;r-nos、pBI121: :p35S-fps-nos和地1121: :p35S-dbr2-nos 中间载体。 阳化5] 上述含酶切位点引物分别为：
[0062] 其中，下划线表示的是酶切位点。
[0063] 3.中间载体pl8T: :fps-nos-p35S-dbr2 载体的构建。
[0064] 用Swal/Xmal酶切上述载体地1121: :p35S-fps-nos，回收fps-nos小片段，并与 PMD18-T相连，形成PMD18-T: :fps-nos。用Xmal/SacI酶切中间载体PMD18-T: :fps-nos和 pBI121: :p35S-dbr2-nos，回收pMD18-T: :fps-nos大片段和dbr2-nos小片段，进行连接，形 成pMD18-T::fps-nos-p35S-dbr2-nos。
[00化]4.pCAMBIA1305. 1: :p35s-hmg;r-nos-p35s-fps-nos-p35S-dbr2-nos载体构建。
[0066] 对地1121: :p35S-hmg;r-nos设计上下游带酶切位点的引物进行PCR扩增，得到 HindIII-35S-hmgr-nos-EcoRI片段，用Hindlll/EcoRI酶切该片段和PCAMBIA1305. 1，回收 大片段，进行连接，得到pCAMBIA1305.I: :p35s-hmg;r-nos。
[0067] 上述含酶切位点引物分别为：
[0068] hmgr-Hindlll-FP ：GCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT
[0069]hmgr-EcoRI-RP：CGAATTCCCGATCTAGTAACA〇
[0070] 其中，下划线表示的是酶切位点。 W71 ] 对pMDlS-T::巧s-nos-p35S-化r2设计上下游带酶切位点的引物进行PCR扩 增，得到NcoI-35S-fps-nos-p35S-dbr2-PmaI片段，用Ncol/Rnll酶切该片段和pCAMBIA1305. 1: :p35s-hmg;r-nos，回收大片段，进行连接，得到pCAMBIA1305. 1: :p35s-hmg;r-nos-p 35s-fps-nos-p35S-dbr2-nos。
[0072] 上述含酶切位点引物分别为：
[0073] fpS-NcoI-FP：TGACCATGAGTAGTACCGATCTGAA
[0074]dbr2-PmlI-RP：CACGTGCTAGAGGAGTGACCCTTTGT〇 [00巧]其中，下划线表示的是酶切位点。
[0076]日.pCAMBIA1305. 1: :p35s-epsps-nos-p35s-hmg;r-nos-p35s-fps-nosp35S-dbr2-n OS载体的构建。
[0077] 利用酶切位点)(hoI切除载体pCAMBIA1305. 1: :p35s-hmg;r-nos-p35s-fps-nos-p3 5S-化r2-nos上的潮霉素基因，回收大片段，并根据上述提到的epsps基因设计含酶切位点 的上下游引物，用化Ol酶切该片段，并连入到大片段中。得到PCAMBIA1305. 1: :p35s-epsp s-nos-p35s-hmgr-nos-p35s-fps-nosp35S-dbr2-nos载体。
[007引上述含酶切位点引物分别为：
[0083] 其中，下划线表示的是酶切位点。
[0084] 6.通过测序确认连入基因的正确性。
[00化]最终获得了将青葛素生物合成途径关键酶基因hmgr、巧S、化r2和巧sps可操作性 地连接于表达调控序列的植物表达载体pCAMBIA1305. 1::p35s-epsps-nos-p35s-hmg;r-nos -p35s-fps-nos-p35S-dbr2-nos，下文简称该表达载体为：pCAMBIA1305. 1: :p35s-epsps-hm 邑r-fps-dbr2〇
[0086]实施例2 阳087] 根癌农杆菌介导hmgr、巧S、化r2和巧sps基因遗传转化青葛获得转基因青葛植株
[0088] 1.含植物表达载体pCAMBIA1305. 1: :p35s-epsps-hmg;r-fps-dbr2 的根癌农杆菌 工程菌的获得
[0089] 将实施例1中获得的含hmgr、巧S、化r2和巧SPS基因的植物表达载体PCAMBIA13 05. 1: :p35s-epsps-hmg;r-fps-dbr2转入根癌农杆菌EHA105 (购自澳大利亚GAMBIA,菌株编 号为Gambar1)，并进行PCR验证。结果表明，含hmgr、巧S、化r2和巧sps基因植物表达载 体pCAMBIA1305. 1: :p35s-epsps-hmg;r-fps-dbr2已成功转化入根癌农杆菌菌株中。
[0090] 2.根癌农杆菌介导的hmgr、巧S、化r2和巧sps基因转化青葛
[0091] 2. I.外植体的预培养
[0092] 青葛种子用75 %乙醇浸泡Imin,再用20%化ClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次， 用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige和Skoog, 1962)固体培养基 中，25°C、1化/她（日光/黑夜）光照培养，即可获得青葛无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪 取无菌苗叶片外植体用于转化。
[0093] 2. 2.农杆菌与外植体的共培养
[0094] 将所述的叶片外植体，转到共培养培养基（1/2MS+ASlOOymol/L)中，滴加含活 化好的植物表达载体pCAMBIA1305. 1: :p35s-epsps-hmg;r-fps-dbr2的根癌农杆菌工程菌 的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28°C暗培养3天。W滴加在不带有目的基因的根 癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。其中，AS为乙酷下香酬。 阳0巧]2. 3.抗性再生植株的筛选
[0096] 将上述共培养3天的青葛外植体转入发芽筛选培养基（MS+6-BA0. 5mg/L+NAA 0. 05mg/L+N-(Phosp