GGCAGAATGGAGCCCATC CGG P2: CCAGCTGCAGCCAAGAGCCACCGGATGGGCTCCATTCTGCCCCGTCCATTGAAGTAGTGA P3: GCAGAATGGAGCCCATCCGGTGGCTCTTGGCTGCAGCTGGAGTGGAGTTTGAAGAGAAAT P4: ATCTTCTGCAGATCCTATAAATTTCTCTTCAAACTCCACTCCAGCTGCAGCCAAGAGCCA P5:AGTGGAGTTTGAAGAGAAATTTATAGGATCTGCAGAAGATTTGGGAAAGTTAAGAAATGA P6:GCTGGAACATCAAACTCCCATCATTTCTTAACTTTCCCAAATCTTCTGCAGATCCTATAA P7:TTGGGAAAGTTAAGAAATGATGGGAGTTTGATGTTCCAGCAAGTACCAATGGTTGAGATT P8:TGTACCAACTTCATCCCATCAATCTCAACCATTGGTACTTGCTGGAACATCAAACTCCCA P9:TGGGAGTTTGATGTTCCAGCAAGTACCAATGGTTGAGATTGATGGGATGAAGTTGGTACA P10:AGTTGAGAATGGCTCTGGTCTGTACCAACTTCATCCCATCAATCTCAACCATTGGTACTT P11:GATGGGATGAAGTTGGTACAGACCAGAGCCATTCTCAACTACATTGCCAGCAAATACAAC P12:TTTATGTCTTTCCCGTAGAGGTTGTATTTGCTGGCAATGTAGTTGAGAATGGCTCTGGTC P13:ACATTGCCAGCAAATACAACCTCTACGGGAAAGACATAAAGGAGAGAGCCCTAATTGATA P14:TGCCATACCTTCTGTATACATATCAATTAGGGCTCTCTCCTTTATGTCTTTCCCGTAGAG P15:GGAGAGAGCCCTAATTGATATGTATACAGAAGGTATGGCAGATTTGAATGAAATGATCCT P16:GTCGACATAAGGGCAGAAGAAGGATCATTTCATTCAAATCTGCCATACCTTCTGTATACA P17:GATTTGAATGAAATGATCCTTCTTCTGCCCTTATGTCGACCTGAGGAAAAAGATGCCAA P18:TTCTCTTTGATCAAGGCAATCTTGGCATCTTTTTCCTCAGGTCGACATAAGGGCAGAAGA P19:CTGAGGAAAAAGATGCCAAGATTGCCTTGATCAAAGAGAAAACAAAAAGTCGCTATTTCC P20:TAACACTTTTTCGAAGGCAGGGAAATAGCGACTTTTTGTTTTCTCTTTGATCAAGGCAAT P21:AACAAAAAGTCGCTATTTCCCTGCCTTCGAAAAAGTGTTACAGAGCCATGGACAAGACTA P22:TCAGCTTGTTGCCAACAAGGTAGTCTTGTCCATGGCTCTGTAACACTTTTTCGAAGGCAG P23:CAGAGCCATGGACAAGACTACCTTGTTGGCAACAAGCTGAGCCGGGCTGACATTAGCCTG P24:ACATAGTAGAGAAGTTCCACCAGGCTAATGTCAGCCCGGCTCAGCTTGTTGCCAACAAGG P25:GCCGGGCTGACATTAGCCTGGTGGAACTTCTCTACTATGTGGAAGAGCTTGACTCCAGCC P26:CAGAGGGAAGTTGGAGATAAGGCTGGAGTCAAGCTCTTCCACATAGTAGAGAAGTTCCAC P27:GGAAGAGCTTGACTCCAGCCTTATCTCCAACTTCCCTCTGCTGAAGGCCCTGAAAACCAG P28:CCGTGGGCAGGTTGCTGATTCTGGTTTTCAGGGCCTTCAGCAGAGGGAAGTTGGAGATAA P29:CTGAAGGCCCTGAAAACCAGAATCAGCAACCTGCCCACGGTGAAGAAGTTTCTACAGCCT P30:GGAGGCTTCCTTGGGCTGCCAGGCTGTAGAAACTTCTTCACCGTGGGCAGGTTGCTGATT P31:TGAAGAAGTTTCTACAGCCTGGCAGCCCAAGGAAGCCTCCCGCAGATGCAAAAGCTTTAG P32:AAGAGCTCCTGAAAATCTTTCTGGCTTCTTCTAAAGCTTTTGCATCTGCGGGAGGCTTCCTTGGGCTG CC PCR反应体系：10XPCRbuffer5.0yl;dNTPs(各2.5mM)4yl;内侧引物（P2-P31) 的添加量为10ng，外侧引物（Pl，P32)添加量为100ng;KODFXtaq0. 4yl(预变性后 加入）；加无菌水定容至50y1。
[0023]PCR反应程序：94°C预热 10min;94 °C，30s;54 °C，30s;72 °C，40s;35 个循环；最后72 °C延伸10min。
[0024](二）试验结果： 经过1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约700bp的片段（图1)。
[0025] 实施例2 克隆鉴定、序列测定 (一）试验方法： 扩增片段采用爱思进生物技术(杭州）有限公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后，克 隆到大连宝生物工程有限公司的pMD-18-Simple T载体上进行克隆鉴定和序列测定。
[0026] 本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得人抗逆相关基因HsGSTA3基因，其碱 基和氨基酸序列信息如SEQIDNo1和SEQIDNo2所示。
[0027](二）试验结果： 测序分析结果显示：人抗逆相关基因HsGSTA3编码阅读框长669bp，编码的蛋白质含 222个氨基酸。
[0028] 实施例3 HsGSTA3基因超量表达载体的构建 将实施例2中测序鉴定正确的含有序列表SEQIDNo1所示核苷酸的DNA片段用及洲1 和5^1进行双酶切，回收纯化后与含有双35S启动子和N0S终止子的pYPX245(Genbank: AY78049. 1)质粒连接，酶切鉴定和序列测定表明含有谷胱甘肽S-转移酶基因的植物表达 单元，将该表达单元插入植物表达载体pCambial301，构建拟南芥谷胱甘肽S-转移酶的植 物表达载体pCAM:HsGSTA3。该表达载体还包含⑶S报告基因和带内含子潮霉素抗性标记 基因。
[0029] 实施例4 拟南芥的遗传转化 (一）试验方法： 将实施例3构建的拟南芥谷胱甘肽S-转移酶的植物表达载体pCAM:HsGSTA3用蘸花 法转化拟南芥，具体方法如下： 1.农杆菌的准备： 1)将pCAM: HsGSTA3用电击法转化根癌农杆菌GV3101，或EHA105,或LBA4404菌株(Biovector Co.，LTD)，得到含有pCAM: HsGSTA3的重组农杆菌，并涂布于含有卡那霉素抗 性的平板筛选转化子。
[0030] 2)挑取农杆菌单菌接种于5mLLB液体培养基(利福平50yg/mL，氯霉素100 yg/mL)中，28 °C，250rpm培养 20h。
[0031] 3)取1mL菌液转接入20-30mLLB液体培养基(利福平50yg/mL，氯霉素100 yg/mL)中，28 °C，250rpm培养约 12h，测 0D600 ~ 1.5。
[0032] 4) 8000rpm，4 °C，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5%鹿糖， 0.05%SilwetL-77)并稀释至 0D600 ~ 0.8。
[0033] 2?拟南芥蘸花法转化： 1)将拟南芥的花薹浸入渗透液中，轻轻搅动约10S后取出，全部转化完毕后，用保鲜袋 罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置，22 °C避光培养，24h后去掉保鲜袋直立培养。
[0034] 2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花 序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。
[0035] 3)生长约两个月后，收集种子，4 °C冰箱储存待用。
[0036](二）试验结果： 经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。
[0037] 实施例5 拟南芥种子的筛选 (一）试验方法： 1)称25-30mg种子放入1. 5ml离心管。
[0038] 2) 1ml75%乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000rpm离心5s，去上清。
[0039] 3)加入1ml过滤后的漂白粉（2. 5%)消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)， 8000rpm离心5s，去上清。
[0040] 4)无菌水洗涤3-4次。
[0041] 5)将种子均匀的播撒到1/2 MS平板(潮霉素50 y g/mL)上，Parafilm膜封口，4 °〇冰箱放置两天，22 °C，16 h光照培养10天。
[0042] 6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株（1\) 培养至开花结实，收集植株上所结T2种子。
[0043] 实施例6 抗逆相关基因HsGSTA3转化植株后的抗逆分析 (一）试验方法： 将转基因拟南芥自交纯和一代，选取3个纯合转化株系，收取种子。播种后，幼苗生长 10-20天，分别用NaCl、甘露醇处理，观察植株的耐盐，耐干旱效果。
[0044](二）试验结果： 结果表明：野生型和转HsGSTA3基因拟南芥在存活率上有明显的差异，转基因植株比 野生型拟南芥抗盐和干旱能力有明显提高。经过盐、干旱处理的转基因与野生型拟南芥的 存活率如表1所示。
[0045] 表1转基因与野生型拟南芥的盐、干旱处理后存活率
【主权项】
1. 人谷胱甘肽S-转移酶基因或其编码的蛋白质或多肽在提高植物抗逆性方面的用 途。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白质或多肽的序列如SEQIDNo2所 不O
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述人谷胱甘肽S-转移酶基因是编码权利 要求2所述的蛋白质或多肽的序列。
4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述人谷胱甘肽S-转移酶基因的核苷酸序 列如SEQIDNo1所示。
【专利摘要】本发明提供了一种人抗逆基因及其制备方法和用途。所述的人抗逆基因是HsGSTA3，其碱基序列如SEQ ID No1。其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No2 所示。本发明利用PTDS技术人工合成HsGSTA3的基因序列，所获得的GST基因能用于植物遗传转化，提高植物抗逆性。
【IPC分类】C12N15-54, A01H5-00, C12N9-10, C12N15-82
【公开号】CN104818259
【申请号】CN201510129700
【发明人】许晶, 田永生, 邢晓娟, 姚泉洪, 彭日荷, 高建杰, 付晓燕, 韩红娟
【申请人】上海市农业科学院
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年3月24日