专利名称：一种水产迟钝爱德华氏菌快速药敏检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于水产致病微生物体外诊断技术领域，具体涉及一种水产动物病原细菌迟钝爱德华氏菌的快速药敏检测试剂盒。
背景技术：
近年来随着水产养殖业的快速发展，水产养殖动物病害问题也日益突出，其中细菌性疾病已在世界范围内对渔业经济造成了巨大的损失。迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)是一种水产动物重要的致病菌，可以感染包括淡水与海水养殖的多种鱼类，并能在短期内引起大量死亡。目前，在水产养殖生产过程中，抗生素的使用仍是解决水产养殖动物细菌性疾病的重要手段，它能在短期起到良好的治疗效果，但由于抗生素在养殖动物疾病防治上的广泛和长期使用，水产耐药微生物种类及数量得到不断攀升。近年来，抗药性迟钝爱德华氏菌菌株也陆续地被分离到，在这种情况下如果无选择地盲目使用抗生素，不但得不到理想的治疗效果，反应会使得菌株的耐药性进一步加剧，从而给水产养殖业甚至人类生命健康安全带来更为严重的危害。因此，为了有针对性地使用抗生素药物以达到理想的治疗效果，对病原微生物开展抗生素敏感试验，以获知菌株的耐药特性，对于指导临床科学、合理、准确用药，避免疾病的暴发流行及微生物耐药性加剧起着关键性的作用。目前，药敏检测方法主要采用K-B纸片法与肉汤稀释法，其中K-B纸片法一般须在专业的微生物实验室条件下进行，需要具备专业知识的人员来操作完成，存在操作繁琐、工作量大、周期长等问题，而且无法获得药物的最小抑菌浓度(MIC)值。肉汤稀释法虽然可以测定药物的MIC值，但实验周期长，有时需要专业的仪器设备辅助，且对结果判读不够直观。因此，以上两种方法都不适合在养殖生产中应用推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种能应用于水产养殖现场的迟钝爱德华氏菌快速药敏检测试剂盒，从而弥补现有技术的不足。本发明的检测试剂盒，由检测板、菌体采集工具、增菌液、药敏检测培养基、显色指示剂、比浊管和比色卡组成；其中检测板包含有用于药敏检测的、包被了含有不同浓度药物和显色指示剂的检测孔，所述显色指示剂为阿尔玛蓝。所述的菌体采集工具为无菌接种环或无菌吸管；所述的增菌液的，其组份及浓度如下牛肉浸粉6 g/L、可溶性淀粉1. 5 g/L、酪蛋白水解物 17. 5g/L、NaCl 10g/L、CaCl2 2. 8mg/L、MgCl2 4mg/L、鱼肉蛋白胨 10g/L。所述的药敏检测培养基的组成如下牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物 17. 5 g、NaCl 10g、2.8 mg CaCl2、4 mg MgCl2、蒸懼水 I L。所述的包被了含有药物的检测孔，是将药物与海藻糖水溶液混合，加入到检测孔中进行阴干制成。本发明检测板还包含有用做质量控制的检测孔和/或生长对照的检测孔。
其中质量控制的检测孔和生长对照的检测孔，是将超纯水与海藻糖水溶液混合后加入到检测孔中进行阴干制成。上述的一种检测板，包含有96个检测孔，呈8行X 12列排列。所述的药物为氨苄青霉素、氟苯尼考、链霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、恩诺沙星或利福平。利用本药敏检测试剂盒进行检测的方法按照以下步骤进行I)利用无菌接种环挑取前期分离纯化的迟钝爱德华氏菌单菌落，置于增菌液管内搅动混匀，然后将增菌液管置于28 °C培养箱内震荡培养，直至增菌液浊度与O. 5麦度比浊管的浊度相当。2)将增菌后的菌液以药敏检测培养基将其稀释1500倍，然后分别滴加于药敏检测和生长对照的检测孔内，每孔滴加90 μ I菌液；而质量控制的检测孔内加入90 μ I无菌的
药敏检测培养基。3)在每个微孔内加入10 μ I显色指示剂，置于28°C培养箱内避光培养8_12h，取出检测板观察微孔内的颜色，进行药敏结果判读，判读标准如下A、若质控区颜色呈蓝色，则试验有效，可以继续进行判读；若呈粉红色，则试验无效，需重新进行检测。B、若生长对照区呈粉色，则可以继续进行MIC判读；若生长对照区呈蓝色则需将检测板置于28°C培养箱内继续培养，至颜色变为粉红色后，再进行MIC判读。C、若质 控区呈蓝色，生长对照区呈粉红色，则判读各列不同药物对菌体的MIC，其中每列与比色卡上细菌增殖阴性对照区内颜色相同微孔的最低药物包被浓度即为待测弧菌的MIC。 本发明根据水生动物病原菌的生长需求，在MH培养基的基础上添加鱼肉蛋白胨、Ca2+和Mg2+，调整了 NaCl浓度，作为迟钝爱德华氏菌的增菌液，可有效促进水产迟钝爱德华氏菌的生长，使得待测菌液在短时间内达到要求浓度，以缩短药敏检测的时间。同时本发明利用一种对细胞安全、无毒的蓝色染料阿尔玛蓝作为生长指示剂，基于氧化/还原反应原理，当细菌生长增殖时，由于细菌细胞内生化反应产生的还原力可将阿尔玛蓝显色剂还原，从而使其颜色由氧化态下的蓝色转变为还原态下的粉红色，这一颜色变化可利用肉眼进行直接判断。由于阿尔玛蓝染料对细胞无毒害作用，直接将其加入药敏检测板微孔内不会影响细菌的生长，从而使得检测操作更加简便、快速，而且可连续监测细菌的增殖动态，因此本发明是一种简便、快捷、敏感、高效的药敏检测方法。
图1 :本发明的一种检测板的不同药物种类及含量的包被示意图。图2 :本发明的比色卡的示意图。图3 :不同增菌液配方对迟钝爱德华氏菌生长的影响。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明进行详细说明。本发明试剂盒所用到的组份如下
I)药敏检测板为常规96孔细胞培养板，也可是其它类型的细胞培养板；2)菌体采集工具为无菌接种环或一次性无菌塑料接种环3)增菌液的一种配制方法如下牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物17. 5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2>4 mg MgCl2、鱼肉蛋白胨 10 g、蒸懼水 I L ；4)0. 5 麦氏比浊管，是以 O. 5ml 的 O. 048M BaCl2 溶液与 99. 5ml 的 O. 36M H2SO4 溶液(1%浓度，V/V)混合配制装于密闭的透明小管内；也可选用商品化的麦氏比浊管；5)比色卡其上划分有细菌增殖阳性对照区及细菌增殖阴性对照区(图2)，其中从细菌增殖阴性对照区到细菌增殖阳性对照区的颜色从蓝色(RGB44、19、185)至粉红色(RGB :255，143，218)渐变；6)选用的药品粘附保护剂海藻糖为试剂级纯度大于99%，显色指示剂采用试剂级的阿尔玛蓝染料，该染料是一种对细胞安全、无毒的氧化/还原指示染料，当细菌生长增殖时，由于细菌细胞内生化反应产生的还原力可将阿尔玛蓝染料发生还原，从而使其颜色由氧化态下的蓝色转变为还原态下的粉红色，这一颜色变化可利用肉眼进行直接判断。实施例1 :水产迟钝爱德华氏菌药敏快速检测微孔板的制备1、药物的配置依据水产常用药物种类和禁用药物目录，确定检测药物的种类为氨苄青霉素、氟苯尼考、链霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、恩诺沙星、利福平，共11种。根据不同药物的特性分别采用不同的溶剂准确配制成浓度为6. 4mg/ml、
6.4mg/ml、5. 1 2mg/ml、6. 4mg/ml、6. 4mg/ml、5. 12mg/ml、6. 4mg/ml、1. 28mg/ml、5. 12mg/ml、
2.56mg/ml、3. 2mg/ml的抗菌药物储液,其中氨节青霉素、硫酸链霉素、阿米卡星、盐酸土霉素、新霉素、强力霉素、多粘菌素B用超纯水配制；氟苯尼考、利福平用甲醇溶解，超纯水稀释配制；恩诺沙星用O.1N的NaOH溶解，超纯水稀释配制；SMZ用O.1NNaOH溶解，超纯水稀释配制，TMP用O.1N的冰醋酸溶解，超纯水稀释配制，以SMZ:TMP=5:1的比例混合配制成复方新诺明。配制好的药物储液经O. 22 μ m滤膜过滤后，置于_20°C保存。2、药敏检测微孔板的制备水产迟钝爱德华氏菌药敏快速检测板为96孔无菌微孔板，共有8行(A-H) 12列(1-12)，根据用途不同分为三个区域药敏检测区(A1:H11)、生长对照区(A12:D12)、质控区(E12:H12)，其中药敏检测区每一列微孔底部包被有不同种类浓度呈倍比稀释的抗菌药物。首先，将包被药物稀释成以下不同浓度氨苄青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、土霉素、强力霉素由高至低的稀释浓度分别为0· 064 μ g/ μ 1、0· 032 μ g/ μ 1、0· 016 μ g/ μ 1、0· 008 μ g/ μ 1、0· 004 μ g/ μ 1、0· 002 μ g/μ 1、0·001 μ g/μ 1、0· 0005 μ g/μ I ；链霉素、新霉素、复方新诺明由高至低的稀释浓度分别为0. 512μ g/μ1、
O.256 μ g/ μ1、O. 128 μ g/ μ1、O. 064 μ g/ μ 1、0. 032 μ g/ μ 1>0. 016 μ g/ μ 1>0. 008 μ g/μ1、0·004 μ g/μ I ；恩诺沙星由高至低的稀释浓度分别为0. 256 μ g/μ 1,0. 128 Ug/μ 1,0. 064 μ g/μ 1、0. 032 μ g/ μ 1、0. 016 μ g/ μ 1、0. 008 μ g/ μ 1、0. 004 μ g/ μ 1、0. 002 μ g/ μ I ；多粘菌素B由高至低的稀释浓度分别为0. 128 μ g/μ 1、0. 064 μ g/ μ1、O.032 μ g/ μ 1>0. 016 μ g/ μ 1>0. 008 μ g/ μ 1、0· 004 μ g/ μ 1、0· 002 μ g/ μ1、0· 001 μ g/μ I ；利福平由高至低的稀释浓度分别为0. 032 μ g/μ 1,0. 016 μ g/μ 1,0. 008 μ g/μ 1、0. 004 μ g/ μ 1、0. 002 μ g/ μ 1、0. 001 μ g/ μ 1、0. 0005 μ g/ μ 1、0. 00025 μ g/ μ I。然后，用超纯水配置lmg/ml的海藻糖溶液，用O. 22 μ m滤膜过滤，将配置好的海藻糖溶液分别与以上不同稀释度的药物按体积比1:1混合，分别取不同浓度的药物混合液20μ I对应地加入微孔板检测区内(A1:H11)。在生长对照区(A12:D12)及质控区(E12:H12)内加入以无菌超纯水与海藻糖溶液1:1混合液20μ I。将微孔板置于无菌超净台内室温阴干，最终获得药敏检测微孔板，4°C保存备用，其具体药物包被种类及包被量如图1所示。实施例2 :快速增菌液的优选为实现迟钝爱德华氏菌快速生长以缩短药敏检测过程，在Mueller-Hinton(MH)培养基配方的基础上，对其进行改良以制成增菌液，改良配方为ΜΗ0 (牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物 17. 5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2、4 mg MgCl2、蒸懼水 I L)、MHl(牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1.5 g、酪蛋白水解物17.5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2,4mg MgCl2、10%鱼汤、蒸馏水I L)和MH2 (牛肉浸粉6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物17. 5 g、NaCl 10 g、2. 8 mg CaCl2、4 mg MgCl2、鱼肉蛋白胨 10 g、蒸懼水 I L)。为测定不同增菌液配方对迟钝爱德华氏菌的增殖效果，分别吸取I ml过夜培养的迟钝爱德华氏菌菌液转入100 ml MHO,MHl和MH2中，混合均匀后取5 mL菌液加入13支无菌试管中，置于28°C摇床180 rpm振荡培养，每隔2 h取样一次，于600 nm波长下测定O. D值，以培养基作为空白对照，绘制不同细菌在不同培养基中的生长曲线。结果显示三种改良配方中，MH2培养基可以缩短迟钝爱德华氏菌的生长延滞期，使迟钝爱德华氏菌快速进入指数生长期，具有最好的细菌增殖效果，因此以下实施例均选用MH2培养基作为增菌液。
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实施例3 :应用水产迟钝爱德华氏菌药敏快速检测微孔板进行药敏检测对比I)从固体培养基平板上挑取迟钝爱德华氏菌JF-1单菌落，将其接种于增菌液中，置于28°C培养箱中震荡培养(转速120rpm)至肉眼可见浑浊。其中所述的迟钝爱德华氏菌增菌液的配方为牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1. 5g、酪蛋白水解物17. 5g、NaCl 10g、鱼肉蛋白胨 10g、lmgCa2+、lmgMg2+、蒸懼水 1L。2)将增菌液用检测培养液调整浓度至O. 5麦度，再稀释1500倍，使菌体浓度达到IX IO5个/ml用于药敏检测使用。其中所述的检测培养液的配方为牛肉浸粉6g、可溶性淀粉1. 5g、酪蛋白水解物 17. 5g、NaCl 10g、lmgCa2+、lmgMg2+、蒸懼水 1L。3)以粗头接种滴管向质控区内的每个微孔里滴加2滴(90μ I)检测培养液，将稀释好的菌液分别滴加于微孔检测板的药敏检测区及生长对照区，每孔滴加2滴。然后，在药敏检测微孔板每个微孔内用细头接种滴管滴加I滴( ομ I)显色指示剂，置于28°C培养箱中静置避光培养8-12h，取出药敏检测微孔板肉眼观察记录各微孔内的颜色变化情况。4)同时，取一块预先参照实施例1同等操作制备的包被不同药物的96孔无菌酶标板，参照药敏检测微孔板平行地滴加待检菌液。然后置于28°C培养箱中静置培养。在药敏检测微孔板进行MIC结果判读的同时，将接种有待检菌的酶标板以酶标仪在595 nm波长下测定各微孔的吸光值。
5)与此同时，采用常规试管稀释法进行MIC测定。在试管中接种Iml浓度为IO5个/mL菌液，分别在每个试管中加入以上11种8个浓度梯度的抗菌药物，终浓度与微孔检测法相同，每个药物浓度处理设置3个重复，置于28°C培养箱中静置培养，肉眼观察至试管出现明显浊度，且浊度不再变化，记录结果，以肉眼观察未出现浑浊的试管对应的最小药物浓度为MIC。6)结果判读(I)根据药敏检测微孔板内的颜色变化情况对药敏结果进行判读，判读标准如下a.若质控区颜色呈蓝色，则试验有效，可以继续进行判读；若呈粉红色，则试验无效，需重新进行检测。b.若生长对照区呈粉色，则可以继续进行MIC判读；若生长对照区呈蓝色则需将检测板置于28°C培养箱内继续培养，至颜色变为粉红色后，再进行MIC判读。c.若质控区呈蓝色，生长对照区呈粉红色，则判读各列不同药物对菌体的MIC，其中每列与比色卡上细菌增殖阴性对照区内颜色相同微孔的最低药物包被浓度即为待测弧菌的MIC。最终药敏检测结果显示，利用显色指示剂的微孔检测板结果表明不同药物不同浓度对迟钝爱德华氏菌生长的抑制作用不同，以每列药物包被孔内颜色与比色卡上细菌增殖阴性对照区颜色相同测试孔的最低药物浓度即为MIC，结果显示，氨苄青霉素、氟苯尼考、链霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素 、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、恩诺沙星、利福平对迟钝爱德华氏菌的 MIC 分别为 O. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、1.6 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、6. 4 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 05 μ g/ml。(2)同时，根据酶标板内各微孔的吸光值对微孔内的细菌存活率进行计算，具体计算方法为细菌存活率=(药物组O. D-空白对照组O. D) / (药物阴性对照组O. D-空白对照组O. D) X 100%,将细菌存活率彡20%微孔内的最低药物浓度判定为MIC值，结果显示，氨苄青霉素、氟苯尼考、链霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、恩诺沙星、利福平对迟钝爱德华氏菌的MIC分别为O. 4μ g/ml、0. 8μ g/ml、3. 2μ g/ml>0. 4 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、1. 6 μ g/ml、0. 4 μ g/ml>0. 8 μ g/ml>6. 4 μ g/ml、3.2 μ g/ml、
0.05 μ g/ml,结果与显色法完全吻合。(3)通过观察试管稀释法测定MIC的结果显示，各试管的浊度需要在28°C培养24h后才能趋于稳定，肉眼无法观察到明显浑浊试管中不同药物的最低浓度为MIC，结果显示，氨苄青霉素、氟苯尼考、链霉素、阿米卡星、土霉素、新霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、恩诺沙星、利福平分别为 O. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、
1.6 μ g/ml、0. 4 μ g/ml、0. 8 μ g/ml、6. 4 μ g/ml、3. 2 μ g/ml、0. 05 μ g/ml,结果与显色法及分光光度法完全吻合。综上所述，利用分光光度比浊法计算细菌存活率，发现细菌存活率< 20%的测试孔所对应的最小抑菌药物浓度与阿尔玛蓝显色法的结果一致。同时，试管稀释法测定出的MIC也与以上两种方法结果一致。因此，本发明利用阿尔玛蓝作为颜色指示剂结合制备的药敏检测微孔板可以准确有效地应用于水产迟钝爱德华氏菌的药敏检测。本发明操作简便，观察方法直观，结果稳定易读，检测时间短，可以作为水产养殖中迟钝爱德 华氏菌敏感药物的快速检测，能够大大缩短药物筛选的时间，有助于养殖过程中爱德华氏菌病的预防和治疗，降低疾病暴发风险，为渔业经济带来潜在效益，具有广阔的应用前景。
权利要求
1.一种水产迟钝爱德华氏菌快速药敏检测试剂盒，由检测板、菌体采集工具、增菌液、药敏检测培养基、比浊管和比色卡组成；其中检测板包含有用于药敏检测的、包被了含有药物和显色指示剂的检测孔，所述显色指示剂为阿尔玛蓝。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的菌体采集工具为无菌接种环或无菌吸管。
3.一种用于权利要求1所述的试剂盒的增菌液，其组份及浓度如下牛肉浸粉6 g/L、可溶性淀粉1. 5 g/L、酪蛋白水解物 17. 5g/L、NaCl 15g/L、CaCl22. 8 mg/L、MgCl2 4 mg/L、鱼肉蛋白胨10g/L。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的药敏检测培养基的组成如下牛肉浸粉 6 g、可溶性淀粉1. 5 g、酪蛋白水解物 17. 5 g、NaCl 15g、2. 8 mg CaCl2,4 mg MgCl2'蒸馏水I L。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的包被了含有药物的显色指示剂的检测孔，是将溶解有药物的海藻糖水溶液与显色指示剂阿尔玛蓝混合，加入到检测孔中进行阴干制成。
6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的检测板还包含有用做质量控制的检测孔和/或生长对照的检测孔。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的质量控制的检测孔和生长对照的检测孔，是将海藻糖水溶液和显色指示剂阿尔玛蓝混合，加入到检测孔中进行阴干制成。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的比色卡上划分有细菌增殖阳性对照区及细菌增殖阴性对照区，其中细菌增殖阴性对照区到细菌增殖阳性对照区的颜色从蓝色(RGB44、19、185)至粉红色(RGB :255，143,218)渐变。
9.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的药物为氨苄青霉素、氟苯尼考、阿米卡星、四环素、土霉素、强力霉素、多粘菌素B、复方新诺明、诺氟沙星、恩诺沙星或利福平。
10.权利要求1所述的试剂盒进行检测的方法，包括如下的步骤 1)利用无菌接种环挑取前期分离纯化的迟钝爱德华氏菌单菌落，置于增菌液管内搅动混匀，然后将增菌液管置于28 °C培养箱内震荡培养，直至增菌液浊度与O. 5麦度比浊管的浊度相当； 2)将增菌后的菌液以药敏检测培养基将其稀释1500倍，然后分别滴加于药敏检测和生长对照的检测孔内，每孔滴加90 μ I菌液；而质量控制的检测孔内加入90 μ I无菌的药敏检测培养基； 3)在每个微孔内加入10μ I显色指示剂，置于28°C培养箱内避光培养8-12h，取出检测板观察微孔内的颜色，进行药敏结果判读，判读标准如下 A、若质控区颜色呈蓝色，则试验有效，可以继续进行判读；若呈粉红色，则试验无效，需重新进行检测； B、若生长对照区呈粉色，则可以继续进行MIC判读；若生长对照区呈蓝色则需将检测板置于28°C培养箱内继续培养，至颜色变为粉红色后，再进行MIC判读； C、若质控区呈蓝色，生长对照区呈粉红色，则判读各列不同药物对菌体的MIC，其中每列与比色卡上细菌增殖阴性对照区内颜色相同微孔的最低药物包被浓度即为待测弧菌的MIC。
全文摘要
本发明涉及一种能应用于水产养殖现场的迟钝爱德华氏菌快速药敏检测试剂盒，本发明的检测试剂盒，包括有检测板、菌体采集工具、增菌液、药敏检测培养基、比浊管及比色卡；其中检测板包含有用于药敏检测的、包被了含有药物和显色指示剂的检测孔，所述显色指示剂为阿尔玛蓝。本发明在MH培养基的基础上添加鱼肉蛋白胨、Ca2+和Mg2+，调整NaCl浓度，作为迟钝爱德华氏菌的增菌液，可有效促进迟钝爱德华氏菌的生长，使得增菌液在短时间内达到要求浓度，以缩短药敏检测的时间。同时利用一种对细胞安全、无毒的蓝色染料阿尔玛蓝，对细胞无毒害作用，直接将其包被在药敏检测板微孔内不会影响细菌的生长，从而使得检测操作更加简便、快速，可连续监测细菌增殖动态。
文档编号C12Q1/20GK103060186SQ20121057121
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年12月24日
发明者刁菁, 杨秀生, 叶海斌, 薛莲, 盖春蕾 申请人:山东省海水养殖研究所